植物生物质是地球上最为丰富和可持续的可再生资源。所以如何提高植物生物质的综合利用率并生产高附加值产品,形成绿色高效的转化模式是现代生物技术的发展目标。植物细胞壁的化学成分的多样性和复杂空间结构形成了“生物质抗降解屏障”,其中纤维素是木质纤维素的主要组成部分,其结晶区结构致密,是生物质高效降解过程中的限速步骤。因此发现并构建高效的结晶纤维素降解酶系成为生物质转化研究的热点。2010年裂解多糖单加氧酶(LPMO)的发现改写了结晶纤维素降解酶系的研究进程,LPMO以氧化方式断键,可以作为“起爆剂”,快速提升结晶纤维素水解酶的降解效率,成为新的研究热点。嗜热毛壳菌是堆肥发酵中的优势嗜热真菌,最适生长温度为50℃,广泛分布在富含纤维素基质的自热生境中,具有高效的纤维素降解能力。因此系统且全面地研究该嗜热真菌的生物质降解偏好性、生物质降解过程中酶系表达的时序性和不同性质降解酶组分间的协同性,可以针对特定底物精准定制高效降解酶系,这对于提高生物质转化效率和绿色可持续发展具有重要意义。本文以嗜热毛壳菌为研究对象,通过基因组学、转录定量分析、蛋白质组学和结构生物信息学等整合组学方法对其相关机制进行研究,取得的主要成果如下:1.分析了嗜热毛壳菌基因组中碳水化合物活性酶类的组成,明确了该菌具有降解结晶纤维素的水解酶与氧化酶的完整酶系,且偏好降解单子叶植物细胞壁。利用生物信息技术分析了该菌基因组中编码的碳水化合物活性酶类(CAZymes)。研究结果表明,嗜热毛壳菌基因组共编码298种CAZymes,其中与纤维素、木聚糖、β-1,3;1,4-葡聚糖降解相关的酶的编码基因比较全面,这些酶系与单子叶植物细胞壁的结构组成相对应,因此该菌具有偏好降解单子叶植物细胞壁的能力。进一步分析发现与结晶纤维素降解相关的酶类,包括5种纤维二糖水解酶(CBHs)、8种β-葡萄糖苷酶(BGs)、10种内切纤维素酶(EGs)、18种AA9LPMOs、2种纤维二糖脱氢酶(CDHs)和8种葡萄糖-甲醇-胆碱氧化还原酶(GMCs),其中CDHs和GMCs理论上可以作为LPMOs的电子供体。因此嗜热毛壳菌具有降解结晶纤维素的水解酶与氧化酶的完整酶系。2.利用比较蛋白质组学方法分析了嗜热毛壳菌不同培养条件下的产酶特性,进一步明确了其偏好降解单子叶植物的细胞壁,且该菌生物质降解酶类的特异诱导物为阿拉伯糖和微晶纤维素;50℃培养时AA9 LPMO的分泌量最高。利用小麦麸皮(WB)和玉米麸皮(CB)两种复杂天然底物、不同培养温度、和8种单一碳源(纤维素类碳源和木聚糖类碳源)对嗜热毛壳菌进行培养,分析其胞外酶液生化性质及胞外蛋白质组的动态变化。结果表明与小麦麸皮(WB)相比,玉米麸皮(CB)可诱导菌体分泌更高含量的胞外蛋白和碳水化合物活性酶类(CAZymes),尤其是CBHs和AA9家族的LPMOs相关酶类。培养温度也可明显影响嗜热毛壳菌胞外CAZymes的分泌和动态变化,尤其是AA9 LPMO。在可溶性糖为底物的培养中,与其它真菌往往利用木糖作为高效诱导物明显不同的是,阿拉伯糖是嗜热毛壳菌木聚糖降解酶类的高效诱导物,可诱导大量木聚糖酶的产生。当以不溶性微晶纤维素(MCC)作为底物时,可诱导菌体分泌大量的纤维素降解相关酶类(5 d时相对含量41%),此时LPMO的种类和含量最多(12种,相对含量13.8%)。通过培养发现了对嗜热毛壳菌CAZymes(尤其是AA9 LPMOs)具有明显诱导作用的两种碳源:阿拉伯糖和MCC,这为深入研究该菌的纤维素降解机制和AA9 LPMO的新型诱导机制奠定了基础。3.转录定量分析结合蛋白质组学方法的研究表明嗜热毛壳菌胞外不同CAZymes有明显的时序性表达,发现高温条件下,MCC高效诱导菌体表达LPM02,并且LPMO2与水解酶CBH及脱氢酶CDH具有共表达现象。利用特异性碳源阿拉伯糖和MCC对嗜热毛壳菌进行时间梯度动态培养,利用蛋白质组和RT-qPCR技术进行了动态跟踪分析。结果表明阿拉伯糖和MCC培养时菌体分泌的CAZymes具有明显的时序性。阿拉伯糖除了诱导木聚糖降解相关酶外,还在培养后期诱导较多的带有CBM1模块的LPMO1和LPMO3;明显不同于阿拉伯糖,MCC可诱导纤维素降解酶的大量表达,主要为水解酶CBHs和氧化酶AA9 LPMOs;同时发现一内切木聚糖酶G0SBF1(GH10+CBM1)可与纤维素酶共表达。MCC特异性诱导菌体分泌LPMO2,结构分析表明LPM02底物结合面中loop3的插入序列扩展了酶分子与底物结合的面积,这可能是LPMO2s在高温条件下能够高效结合并降解结晶纤维素的原因。在高温条件下,MCC诱导菌体胞外LPMO2s、CBHs和CDHs的高效共表达,这说明纤维素氧化酶与水解酶之间存在明确的协同关系,对构建精简高效的酶复合制剂具有指导意义。4.利用整合组学方法对嗜热毛壳菌纤维素高效降解酶系进行了关联分析,结果显示高温下LPMO1和CBHI、LPMO2和CBHⅡ具有明显的协同表达。以MCC为诱导物对嗜热毛壳菌进行前期培养,利用整合组学进行跟踪分析。结果表明,高温条件下(50℃),多组分的纤维素酶与多组分的LPMO中,CBHⅡ 和LPMO2在转录水平与蛋白表达水平都具有明显正相关性,并且LPMO与CDH之间也具有表达相关性,确定CDH、LPMO2和CBHⅡ的共表达,三者可能具有相同的转录调控机制。另外CBHⅠ 与LPMO1也具有共表达现象。进一步分析发现,与CBHⅡ共表达的LPMO2大多无CBM1辅助模块。本研究细化了嗜热毛壳菌在高温条件下不同酶组分之间的协同表达模式,发现高温条件下LPMO1和CBH Ⅰ、LPMO2和CBHⅡ的共表达现象,这为进一步丰富和完善结晶纤维素的降解理论体系奠定基础,为工业应用中复配出更加高效的酶制剂提供新的方案与思路。5.利用酵母异源表达系统,成功克隆表达了嗜热毛壳菌的一种LPMO2蛋白,表征了其酶学性质,初步建立了 LPMO氧化还原酶的电极分析系统。构建了10个嗜热毛壳菌AA9LPMO酵母表达质粒,成功克隆表达并分离纯化了蛋白LPMO2-G0SH69,利用2,6-DMP法快速测定了其活性。基本酶学性质表明该酶是可以耐受60℃的氧化酶类。根据该酶为氧化酶,具有传递电子的能力,具有应用到电极的潜力,因此初步建立了 LPMO的电化学检测分析体系,这有助于人们对LPMO相关机制的深入研究,为底物种类优化、电子传递机制、产物形成效率等分析提供了方法和平台,从而推动AA9LPMO机理与功能的阐明,进而丰富人们对嗜热条件下木质纤维素降解的深入认识。