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目的:首先利用shAURKA和AURKA过表达载体转染人肝癌细胞系HepG2,构建肝癌稳定转染细胞系,通过体内和体外实验探讨AURKA蛋白激酶介导DNA损伤修复通路参与肝癌细胞HepG2的相关机制。接着探讨AURKA激酶抑制剂MLN8237对HepG2肝癌细胞体外增殖影响的分子机制。方法:(1)利用shAURKA和AURKA过表达载体转染人肝癌细胞系HepG2,构建肝癌稳定转染细胞系;针对肝癌稳定转染细胞系,利用CCK8、细胞克隆形成实验探讨AURKA对肝癌细胞增殖的影响;利用细胞划痕实验探讨AURKA对肝癌细胞迁移侵袭能力的影响;通过Western blot实验研究AURKA参与肝细胞癌发生发展的机制;并通过细胞荧光成像实验检测AURKA对肝癌细胞有丝分裂的影响。(2)用肝癌稳定转染细胞系建立人肝癌裸鼠皮下成瘤模型,进行体内荧光成像实验及HE、TUNEL染色等探讨AURKA对人肝癌裸鼠皮下成瘤模型生长和凋亡的影响。(3)将HepG2肝癌细胞分为对照组和加入不同浓度AURKA激酶抑制剂MLN8237的观察组。运用CCK8法、细胞克隆形成实验检测药物对细胞增殖能力的影响;细胞凋亡实验检测药物对细胞凋亡的影响;细胞划痕实验观察药物对肝癌细胞迁移侵袭能力的影响;Western blot实验检测AURKA和DNA损伤等相关蛋白的表达水平;将不同浓度的MLN8237作用于HepG2细胞并接受不同剂量的β线照射后,采用CCK8试剂检测细胞存活率以探讨MLN8237对肝癌细胞的放射增敏作用。结果:(1)采用瞬时转染方法成功构建两组肝癌稳定转染细胞系。(2)通过对肝癌稳定转染细胞系进行一系列体外实验,实验结果提示沉默AURKA表达可抑制肝癌细胞增殖活性、抑制肝癌细胞迁移侵袭能力。接着进行了肝癌稳定转染细胞系的α-微管蛋白免疫荧光染色,在共聚焦显微镜下观察结果显示沉默AURKA表达可抑制肝癌细胞有丝分裂,诱导细胞发生凋亡。(3)Western blot实验结果表明AURKA参与肝癌发生发展的机制可能通过DNA损伤修复通路,AURKA可直接改变ATM/Chk2和ATR/Chk1介导的DNA损伤修复网络和DNA损伤反应蛋白。(4)通过将获得的稳定转染细胞系建立人肝癌裸鼠皮下成瘤模型,观察人肝癌皮下成瘤生长情况及对人肝癌裸鼠皮下成瘤实验肿瘤标本组织切片进行HE和TUNEL染色,结果显示AURKA促进人肝癌裸鼠皮下成瘤的生长;AURKA可促进肝癌细胞增殖及抑制肝癌细胞发生凋亡和坏死,从而促进肿瘤组织生长。(5)AURKA激酶抑制剂MLN8237抑制HepG2细胞增殖能力、迁移侵袭能力并促进HepG2细胞凋亡,并随着MLN8237浓度增高,抑制/促进作用越明显。接着Western blot实验结果显示MLN8237可促进细胞DNA损伤修复反应。(6)将不同浓度的MLN8237作用于HepG2细胞并接受不同剂量的β线照射,采用CCK8实验检测HepG2细胞存活率。结果表明MLN8237可以有效地提高肝癌细胞对放射治疗的敏感性,提高对肝癌细胞的杀伤力。结论:本研究结果提示AURKA蛋白激酶介导DNA损伤修复通路促进HCC的发生发展,抑制AURKA可通过抑制细胞增殖、促凋亡效应等实现抗肿瘤活性作用,为肝癌的临床治疗和诊断提供实验依据,AURKA有希望成为治疗HCC的新靶点。同时本研究结果表明AURKA激酶抑制剂MLN8237可降低HepG2细胞恶性程度,并通过下调细胞中AURKA蛋白表达,促进细胞凋亡及促进细胞DNA损伤修复反应,防止细胞发生恶性转变,有望成为治疗肝细胞癌的特异分子靶向药物。