苹果树腐烂病菌(Valsa mali var. mall),是苹果树上一种具有毁灭性的子囊菌类病原真菌,其在植物体内可分泌木聚糖酶、纤维素酶和果胶酶等,来降解植物细胞壁促进病原菌侵入寄主体内。该病菌引起的苹果树腐烂病在中国已造成了严重的经济损失,由于缺乏对其致病基因和致病机理的了解,导致腐烂病尚无法得到有效控制。前期研究表明,腐烂病菌分泌的木聚糖酶是其关键致病因素之一。为了更好地了解木聚糖酶在腐烂病菌致病性中的作用,我们克隆了两个木聚糖酶基因Xylanase Ⅰ和Xylanase Ⅱ,对两个基因的表达情况进行了分析,并对基因进行了敲除,初步验证了基因功能。两个木聚糖酶基因的序列分析结果显示,Xylanase Ⅰ的cDNA包含5’端和3’端全长为1626bp,开放阅读框为1320bp,编码蛋白的相对分子量为43.8kDa,等电点为4.4。根据其氨基酸序列比对显示,其与糖基水解酶10家族有很大的同源性。根据已知10家族XynAS9的晶体蛋白结构,预测了Xylanase Ⅰ假定蛋白的3D结构,在空间结构上呈“碗状”,第149位和256位谷氨酸残基被认定为催化区域。Xylanase Ⅱ的cDNA包含5’端和3’端全长为969 bp,开放阅读框为681 bp,编码蛋白的相对分子量为23.8 kDa,等电点为5.29。根据其氨基酸序列比对显示,其与糖基水解酶11家族有很大的同源性。根据已知11家族Xylanase 11C的晶体蛋白结构,预测了Xylanase Ⅱ假定蛋白的3D结构,在空间结构上呈“右手半握状”,第122位和第213位谷氨酸残基被认定为催化区域,第113位和第124酪氨酸氨基酸残基被认定为底物结合区域。构建了两个木聚糖基因的重组表达载体pET-Xylanase,并对其原核表达条件进行了优化。Xylanase Ⅰ重组蛋白的最佳表达条件为：0.5 mmol/L IPTG在30℃诱导12 h。Xylanase Ⅱ重组蛋白的最佳表达条件为：0.1 mmol/L IPTG在15℃诱导10h,且上清中有可检测到木聚糖酶活性的可溶性蛋白。通过Western blot技术对重组表达蛋白进行了验证,结果显示分别在63 kDa和42 kDa有特异蛋白条带。利用荧光定量RT-PCR技术,对离体培养基和苹果枝条中的两个木聚糖酶基因的表达情况进行了测定。结果表明,基础培养基中添加苹果枝条提取物和燕麦木聚糖作为唯一碳源,在较高温度下(25～30℃)均可诱导Xylanase Ⅰ和Xylanase Ⅱ的表达,而添加葡萄糖作为唯一碳源,仅诱导了Xylanase Ⅰ的表达。腐烂病菌在对苹果离体枝条和愈伤组织的侵染过程中,Xylanase Ⅰ和Xylanase Ⅱ的表达量显著升高且一直持续表达,暗示两个木聚糖酶基因在腐烂病菌的致病性中发挥了关键作用。在上述研究基础上,对苹果树腐烂病菌的木聚糖酶基因Xylanase Ⅰ进行了敲除,以进一步验证其基因功能。利用Double-joint PCR将标记基因与目的基因上下游连接,构建基因敲除盒。通过PEG介导的原生质体转化法对目的基因进行敲除,获得139个敲除突变体。对突变体进行PCR检测,仅获得1个Xylanase Ⅰ基因的敲除突变体。对Xylanase Ⅰ基因敲除突变体进行生物学特性和致病性检测,发现敲除突变体在菌落颜色、菌落形态、菌落生长速度与野生型菌株LXS080901相比,均没有明显差异,但将敲除突变体接种苹果离体枝条,发现其致病力与野生型菌株LXS080901相比,显著降低;测定发病组织中木聚糖酶活性发现,敲除突变体产生的木聚糖酶活性明显低于野生菌株的。表明Xylanase Ⅰ基因在苹果树腐烂病菌致病过程中具有重要作用。本研究对苹果树腐烂病菌的重要致病因子木聚糖酶进行了基因克隆、表达分析并对基因功能进行了验证,为今后进一步全面解析苹果树腐烂病菌的致病机理奠定了理论基础。