溶藻弧菌外膜蛋白的抗原性分析及其亚单位疫苗的研制

来源 :湛江海洋大学 广东海洋大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:luoqiuqiu80
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本文从溶藻弧菌中提取外膜蛋白,用丙酮沉淀法提取的外膜蛋白,经SDS-PAGE电泳,凝胶用考马斯亮蓝G-250染色后,图谱显示一条主区带及十多条次要区带,其中八条主要蛋白质带的分子量分别为61.8 kD、57.2 kD、47.8 kD、39.3 kD、35.6 kD、33.3 kD、26.4 kD和24.4 kD。用十二烷酰基肌氨酸钠法提取的外膜蛋白经SDS-PAGE电泳,图谱显示一条主区带及三条次要区带,而且主区带的蛋白浓度很高,分子量为35.6 kD,其它三条蛋白带的分子量分别为47.8 kD、43.1 kD、39.3 kD。 用Western blot印迹结果显示出分子量约为35.6 KD的OMP与兔抗溶藻弧菌血清发生了免疫反应,同时还有两条微弱的显色带,其分子量分别为39.3 kD和47.8 kD,这表明35.6 kD外膜蛋白具有较强的免疫原性,能刺激机体产生免疫应答。因而,初步认为35.6 kD外膜蛋白是溶藻弧菌的主要外膜蛋白。 应用透析法制备免疫激发复合物型亚单位疫苗(ISCOM-OMPs),经检查无菌,疫苗安全性检测结果表明,0.5mg/mL ISCOM-OMPs和1.0 mg/mL ISCOM-OMPs对紫红笛鲷(约50g)安全无毒副作用;而1.5 mg/mL ISCOM-OMPs对紫红笛鲷有低毒,其特征是肝脾肿大、充血,皮肤出血,由于1.5 mg/mL ISCOM-OMPs对紫红笛鲷的低毒性,故在保护性实验中未采用此浓度。 用凝集法测定6.0mg/mL外膜蛋白组的鱼血清效价先缓慢升高,在第35天时达到峰值,约1:90,然后缓慢下降。 用凝集法测得1.0mg/mL外膜蛋白亚单位疫苗组(ISCOM-OMPs)的鱼血清特异性抗体效价不断增加,在第21天时达到峰值约1:256,第28~49天,抗体效价变动不大仍维持在较高水平。 不同浓度的OMPs腹腔接种紫红笛鲷后用4.8×108cfu/mL溶藻弧菌活菌腹腔攻毒,1.5mg/mL外膜蛋白组、3.0mg/mL外膜蛋白组、6.0mg/mL外膜蛋白组对溶藻弧菌的免疫保护率分别为25%、37.5%、62.5%,对照组的存活率仅为20%。 不同浓度的ISCOM-OMPs亚单位疫苗腹腔接种紫红笛鲷后用4.8×108cfu/mL溶藻弧菌腹腔攻毒,注射外膜蛋白亚单位疫苗ISCOM-OMPs浓度0.5mg/mL和1.0mg/mL组对溶藻弧菌的免疫保护率分别为43.2%和77.3%。 受免鱼血清中的溶菌活力在注射后急剧上升,在第二个星期时达到最高值约0.362,与溶菌酶含量的变化相一致,而抗菌活力变化不显著。 疫苗免疫后,紫红笛鲷的头肾和脾脏经甲基绿派诺宁染色,免疫后第七天,脾脏中鞘动脉周围嗜派诺宁细胞明显增加,淋巴细胞核明显增大并母细胞化,嗜派诺宁细胞数量在红髓和小动脉周围未见明显变化。免疫后第二十八天,嗜派诺宁细胞继续增加,其数量达到整个免疫过程的最高峰,不仅在鞘动脉周围,而且在小动脉周围和脾索中均有分布,特别是在红髓部位,嗜派诺宁细胞数量最丰。免疫后第四十九天,嗜派诺宁细胞数还较多,散在分布于淋巴组织中,浆细胞数继续增多,并且从鞘动脉内区到外区以及红髓部位,浆细胞逐渐增加。紫红笛鲷免疫后第七天,与脾脏相比,头肾的嗜派诺宁阳性细胞即B淋巴母细胞数量较多,散在分布于头肾实质中。免疫后第二十八天,嗜派诺宁细胞开始减少,但在窦状隙周围,嗜派宁细胞数未发生明显的减少,在光镜下形成嗜派诺宁细胞团。免疫后第四十九天,嗜派诺宁细胞基本上全部消失。经抗原刺激后,头肾的嗜派诺宁细胞出现早且多于脾脏,可见头肾对抗原的免疫应答早于脾脏。
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