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研究背景：调动机体内源性保护机制,增加机体的抗损伤能力是预防和治疗缺血/再灌注心脏损伤的重要措施之一。缺血后处理是于组织长期缺血后、再灌注之前进行反复短暂的再灌注/缺血处理,以减轻缺血/再灌注所致的组织损伤的一种方法,是迄今已知最强的内源性细胞保护现象之一。但是其保护机制的分子靶点尚不清楚。线粒体凋亡途径是缺血/再灌注诱导心肌细胞凋亡,造成心肌损伤的主要途径。而抑制心肌细胞凋亡又是缺血后处理保护心肌的关键所在。由此产生的问题是：缺血后处理是否通过调控参与线粒体凋亡途径的关键分子来发挥作用呢?PUMA (p53upregulated modulator of apoptosis)是位于线粒体的p53靶基因,它具有强大的促凋亡功能。ARC是迄今为止在心脏发现的高度特异,且大量表达的抗凋亡蛋白,其全称是带有caspase富集功能域的凋亡抑制因子(apoptosis repressor with a caspase recuitment domain,简称ARC)。研究已经证实ARC和PUMA是调控线粒体凋亡途径的重要分子。既然缺血后处理具有明确的抗线粒体凋亡途径的作用,而PUMA和ARC的促凋亡作用和抗凋亡作用又是以线粒体为靶点实现的,那么,缺血后处理是否以PUMA和ARC为靶分子,通过抑制线粒体凋亡途径实现其心肌保护作用呢?目前尚不清楚。研究目的：采用体外培养的乳大鼠心肌细胞缺氧后处理模型(模拟整体水平缺血后处理模型),研究调控PUMA和ARC表达与缺氧后处理抑制线粒体凋亡途径的关系,证实缺氧后处理通过下调PUMA的表达、上调ARC的表达,抑制线粒体凋亡途径,实现其心肌保护作用。研究方法：1.乳大鼠心肌细胞缺氧/复氧和缺氧后处理模型的建立：培养的乳大鼠心肌细胞置于缺氧仓中缺氧3h后,持续复氧3h复制缺氧/复氧模型。培养的乳大鼠心肌细胞置于缺氧仓中缺氧3h后,持续复氧之前进行3次反复短暂的复氧／缺氧处理,复制缺氧后处理模型。2.心肌细胞凋亡的研究：用Propidium Iodide和Annexin-V标记心肌细胞,采用流式细胞仪检测法研究心肌细胞凋亡的变化。3.心肌细胞死亡率的研究：用台盼蓝染色法研究心肌细胞死亡的变化。4.检测PUMA和ARC蛋白表达：提取心肌细胞总蛋白,采用Western blot方法研究PUMA和ARC蛋白表达的变化。5.检测细胞色素c和Bax在线粒体和胞浆中的表达：提取心肌细胞线粒体和胞浆,采用Western blot方法研究细胞色素c和Bax表达的变化。6. caspase-3活性的检测：采用caspase-3活性检测试剂盒研究caspase-3活性的变化。7.数据处理及统计学分析：各组实验数据以均数±标准差(夏±s)表示,以统计学软件SPSS13.0分析,多组间两两比较用Bonferroni’s test,P<0.05认为具有显著性差异。实验结果：1.缺氧后处理下调PUMA,减轻心肌细胞缺氧/复氧损伤(1)缺氧/复氧上调PUMA,诱导心肌细胞凋亡：与常氧培养的对照组比较,缺氧/复氧诱导心肌细胞PUMA mRNA和蛋白表达明显上调(P<0.001),与此同时,心肌细胞凋亡率和的死亡率明显高于对照组(P<0.001)。而用siRNA抑制内源性PUMA的表达后再进行缺氧/复氧,心肌细胞凋亡率和死亡率明显降低,与单纯缺氧/复氧组比较,差异显著(P<0.001)。(2)缺氧后处理通过抑制PUMA表达减轻心肌细胞缺氧/复氧损伤：在心肌细胞缺氧后复氧前进行3次反复短暂的复氧/缺氧处理,以复制缺氧后处理模型,研究缺氧后处理条件下PUMA mRNA和蛋白表达以及心肌细胞的凋亡率和死亡率的变化。结果显示：缺氧后处理明显下调缺氧/复氧诱导的PUMA mRNA和蛋白表达(与缺氧/复氧比较P<0.001)。与之相应的是,给予缺氧后处理的心肌细胞凋亡率和死亡率明显减少(与缺氧/复氧比较P<0.001)。但是当用ad-PUMA腺病毒感染心肌细胞,获得过表达PUMA的心肌细胞后,然后进行缺氧后处理,明显降低缺氧后处理的细胞保护作用,表现为心肌细胞凋亡率和死亡率明显高于单纯的缺氧后处理组(P<0.001)。2.ARC在缺氧后处理心肌保护中作用的研究(1)生理条件下ARC在心肌细胞存活中的作用：分别用antisense-ARC和scramble-ARC转染心肌细胞,发现：antisense-ARC抑制内源性ARC蛋白表达的同时,可以增加心肌细胞凋亡率和死亡率(P<0.05)；而scramble-ARC对内源性ARC蛋白表达以及心肌细胞凋亡率和死亡率无明显影响(P>0.05)。(2)研究ARC是心肌细胞在缺氧/复氧条件下存活的关键因子：缺氧/复氧可以明显下调ARC的蛋白表达,增加心肌细胞的凋亡率和死亡率(P<0.05)。而用ARC腺病毒感染心肌细胞后,获得ARC过表达的心肌细胞,然后进行缺氧/复氧处理,心肌细胞的凋亡率和死亡率明显低于缺氧/复氧组(P<0.05)。但是用β-gal腺病毒感染心肌细胞,再进行缺氧/复氧处理,心肌细胞的凋亡率和死亡率与单纯的缺氧/复氧组比较无显著性差异(P>0.05)。(3)探究ARC在缺氧后处理抑制缺氧/复氧诱导心肌损伤中的作用：缺氧后处理在明显抑制缺氧/复氧诱导的ARC蛋白表达下调的同时,可以明显降低缺氧／复氧诱导的心肌细胞的凋亡率和死亡率增加(P<0.01)。但是用antisense-ARC抑制内源性ARC的表达,缺氧后处理对心肌细胞的凋亡率和死亡率的抑制作用明显降低(P<0.01)。而用scramble-ARC转染细胞后,缺氧后处理对心肌细胞损伤的保护作用无明显变化(P>0.05)。3.缺氧后处理以PUMA和ARC为靶分子抑制心肌细胞凋亡的途径研究(1)缺氧后处理以PUMA和ARC为靶分子抑制线粒体膜电位减低：缺氧后处理可以明显抑制缺氧/复氧诱导的线粒体膜电位下降(P<0.01,与缺氧／复氧组比较)。与此相对照,用adPUMA转染心肌细胞获得PUMA过表达细胞或者antisense-ARC抑制内源性ARC的表达后,再进行缺氧后处理,线粒体膜电位与单纯的缺氧后处理组比较差异显著(P<0.01)。而用β-gal或scramble-ARC转染心肌细胞,再进行缺氧后处理,线粒体膜电位与单纯的缺氧后处理组比较无显著性差异(P>0.05)。(2)缺氧后处理以PUMA和ARC为靶分子抑制细胞色素c释放和Bax转位：正常对照组Bax表达在胞浆中,细胞色素c表达在线粒体中。在缺氧／复氧条件下,Bax从胞浆转位至线粒体,细胞色素c从线粒体释放至胞浆。而给予缺氧后处理细胞,Bax在线粒体中的表达和细胞色素c在胞浆中的表达明显减少。与此相对照,当用adPUMA或antisense-ARC转染心肌细胞,然后研究PUMA基因过表达或者ARC基因被抑制后缺氧后处理对Bax转位和细胞色素c释放的影响,结果发现：过表达PUMA或者降低内源性ARC的表达后可以明显抑制缺氧后处理对Bax转位和细胞色素c释放的阻断作用。研究结论：1.缺血后处理通过下调促凋亡因子PUMA的表达,上调抗凋亡因子ARC的表达,抑制缺血／再灌注所致心肌细胞损伤。2.缺血后处理以PUMA和ARC为靶分子,通过抑制线粒体凋亡途径,发挥其抗心肌细胞凋亡的作用。