目的：　　 筛选大肠埃希菌耐药质粒编码的未知功能的新基因，并对其进行生物信息学分析、克隆、原核细胞表达和初步的功能研究，为今后大规模功能未知基因的分子遗传学研究建立研究平台。　　 方法：　　 本实验对来自不同年份的320株多重耐药大肠埃希菌质粒DNA进行高通量测序，通过一系列的生物信息学工具筛选出耐药质粒编码的功能未知基因，运用聚合酶链反应(PCR)技术扩增出新基因的开放阅读框(ORF)，克隆入pUC19-T载体，转化于E.coliJM109感受态细胞，蓝白斑筛选阳性克隆，进行酶切和测序鉴定。将测序验证成功的阳性质粒双酶切后与表达载体pET-28a连接，转化于感受态细胞E.coliBL21中，用加有抗菌药物的琼脂平板进行重组菌筛选。经IPTG诱导蛋白表达，并采用SDS-PAGE检测目的蛋白的表达情况。用琼脂平皿稀释法对对照菌与重组菌同时进行MIC测定。采用超声破碎法进行重组菌粗酶液的大量提取，His亲和层析纯化粗酶，等电聚焦电泳测定其pI。测序结果进一步进行氨基酸序列比对和保守结构域、信号肽、跨膜区、疏水性等生物信息学分析。　　 结果：　　 1高通量测序结果：第一批数据中包含160株多重耐药大肠埃希菌(E1)的Solexareads总数为11，077，768:可以定位到功能未知基因的序列(mappedreads)为9933，占总reads的比例约为0.09％，编码新的未知功能的基因有532个。第二批数据包括160株多重耐药大肠埃希菌(E2)的Solexareads总数为9，377，792;mappedreads为11906，占总reads的比例约为0.13％，编码新的未知功能的基因有516个。　　 2对其中的部分功能未知基因进行克隆，结果初步构建成功50个新基因的表达载体。　　 3细菌裂解液的SDS-PAGE电泳结果表明pET28a∷bqy09201等27株携带表达载体重组菌经诱导后可以高效表达目的蛋白，pET28a∷bqy03052等21株重组菌表达的蛋白与对照菌没有显著差异，pET28a∷bqy022和pET28a∷bqy09066重组菌表达的蛋白甚至比对照菌表达的条带更少。　　 4MIC结果表明：跟对照菌相比，绝大多数重组菌对抗菌药物的耐药性没有显著差异。有3株重组菌的耐药性较对照菌明显增加：pET∷bqy09232/E.coli重组菌对氨苄西林、头孢呋辛、头孢唑啉有显著耐药性差异；pET∷bqy09201/E.coli重组菌对氨苄西林、头孢呋辛、四环素、红霉素有耐药性差异；pET::bqy021/E.coli重组菌对头孢替安有耐药性差异。有4株重组菌的耐药性较对照菌反而明显下降(pET∷bqy09235/E.coli、pET∷bqy09009/E.coli、pET∷bqy03053/E.coli、pET∷bqy017/E.coli)。　　 5测序分析验证了bqy09201基因的开放读码框包含1182bp，GenBank收录号为JF437869，编码393个氨基酸，与网上公布的编码区相符合，经克隆、表达、提取蛋白纯化后，等电点测定为4.7，相对分子质量为58kDa，与理论预期的分子量大小相符。　　 6对Bqy09201蛋白氨基酸序列进行同源性分析表明该蛋白与美人鱼发光杆菌杀鱼亚种和拟态弧菌的相应基因具有较高的同源性，保守结构域为KorB和未知功能的ParBcsuperfamily，为非跨膜蛋白，不含信号肽，具有一些化学修饰位点。其氨基酸含有1个N糖基化位点，1个依赖cAMP和cGMP的蛋白激酶磷酸化位点，4个蛋白激酶C磷酸化位点，7个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点，5个N端豆蔻酰化位点，1个酰胺化位点。该蛋白定位于细胞质中。　　 结论：　　 1新一代高通量测序技术结合生物信息学工具对于混合样本中新编码基因的筛选是一种极为有效的方法。　　 2成功克隆了50个功能未知基因，其中3个基因与细菌的耐药性相关。　　 3借助于生物信息学方法了解了bqy09201基因可能的性质和功能，通过研究该基因的蛋白表达、提取纯化、分子量测定、等电点测定、耐药功能的检测，为该基因的功能进一步研究奠定了基础。