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六月青是广西壮族的特色药材,系爵床科(Acanthaceae)植物,又叫肖鸡笼或顶头马兰[Tarphochlamys affinis (Griff) Bremekhu]或rStrobilanthes affinis (griff) Y. C. Tang]的干燥地上部分,具有广泛的保肝抗肝炎等药理活性,目前国内外只有本课题组对其进行了长期深入的研究。研究证实,六月青提取物具有较强的抗氧化、抗肝损伤、抗肝纤维化、抗乙肝以及抗肿瘤等作用。由系统预分析实验可知,六月青中含有皂苷、内酯类、酚类、有机酸、鞣质类及糖和苷类等成分。随着课题的深入,六月青具体含有哪些有效的活性单体成分有待于我们进一步研究。本实验在前期研究的基础上,对六月青化学成分进行提取、分离、纯化和结构鉴定,并对六月青化学成分进行了体外清除氧自由基、抗肿瘤、抗乙肝以及对肝星状细胞影响的研究,以筛选六月青有效的活性成分,为进一步研究六月青单体生物活性及作用机制奠定基础,并为开发广西新药提供理论依据。第一部分六月青化学成分的研究目的：研究六月青的化学成分。方法：采用色谱技术分离纯化,并通过波谱技术及理化性质鉴定化合物结构。结果：从六月青中分离得到20个化合物,分别为：taraffinisoside A (1), descaffeoyl crenatoside (2), deacyl martynoslde (3),3,4-dihydroxyphenylethanol-8-O-[β-D-apiofuranosyl (1→3glucopyranoside(4), hydrangeifolin I (5),(—)-syringaresinol4-O-β-D-apiofuranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranoside (6), hydrolytichazaleanin A (7),(6R,7S,8S)-7α-[(β-glucopyranosyl)oxy]lyoniresinol (8),(6S,7R,8R)-7a-[(β-glucopyranosyl)oxy]lyoniresinol (9),(—)-4-epi-lyoniresinol3a-O-β-D-glucopyranoside (10),(—)-lyoniresinol2a-O-β-D-glucopyranoside (11),桦木醇(12),β-胡萝卜苷(13),对羟基苯甲醛(14),对羟基苯乙酮(15),水杨酸(16),十六碳烯酸(17),亚油酸(18),9,12,15-十八碳三烯酸(19),化合物20结构待定。结论：化合物1为新化合物,其它化合物均为首次从该植物中分离得到。第二部分六月青化学成分抗氧化活性研究目的：研究六月青8种化学成分——taraffinisoside A (1)、descaffeoyl crenatoside (2)、deacyl martynoslde (3)、3,4-dihydroxyphenylethanol-8-O-[β-D-apiofuranosyl (1→3)]-β-D-glucopyranoside (4)、hydrangeifolin Ⅰ(5)、(-)-syringaresinol4-O-β-D-apiofuranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranoside (6)、(6R,7S,8S)-7α-[(β-glucopyranosyl)oxy]lyoniresinol (8)和桦木醇(12)的抗氧化活性。方法：采用酶标仪微量法和紫外分光光度法,以维生素C为阳性对照,分别测定六月青8种化学成分对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH·)自由基、羟基自由基(·OH)和超氧阴离子自由基(02-·)的清除能力。结果：化合物1、2、3、4、6、8对DPPH表现出明显的清除作用,半数清除率IC50分别为10.36pM,19.73μM,43.95μM,15.30μM,46.04μM和35.59μM,且成明显的量效关系。化合物1、2、3、4、6、8对OH自由基表现出明显的清除作用,半数清除率IC50分别为17.61μM,20.65μM,36.16μM,29.38μM,41.26pM和31.23μM,且成明显的量效关系。化合物1、2、3、4、6、8对超氧阴离子自由基表现出明显的清除作用,IC50分别为19.68μM,20.61μM,24.39μM,19.71μM,47.84μM和31.20μM,且成明显的量效关系。化合物5和12对三种自由基均未表现出清除作用。结论：六月青含有一系列体外抗氧化活性成分,包括化合物1、2、3、4、6、8。第三部分六月青化学成分体外抗肿瘤活性研究目的：研究六月青8种化学成分———taraffinisoside A (1)、descaffeoyl crenatoside (2)、deacylmartynoslde (3)、3,4-dihydroxyphenylethanol-8-O-[β-D-apiofuranosyl (1→3)]-β-D-glucopyranoside (4)、hydrangeifolin I (5)、(—)-syringaresinol4-O-β-D-apiofuranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranoside (6)、(6R,7S,8S)-7α-[(β-glucopyranosyl)oxy]lyoniresinol(8)和桦木醇(12)的体外抗肿瘤活性。方法：采用体外细胞培养技术,以顺铂DDP为阳性对照药,用MTT法分别测定六月青8种化学成分对人鼻咽癌细胞株CNE2、人肝癌细胞株HepG2、人舌癌细胞株Tca8113人肺癌细胞株A549和人宫颈癌细胞株Hela的增殖抑制作用。结果：化合物桦木醇(12)对人鼻咽癌细胞株CNE2、人肝癌细胞株HepG2、人舌癌细胞株Tca8113、人肺癌细胞株A549和人宫颈癌细胞株Hela的增殖表现出明显抑制作用,半数抑制率IC50分别为15.73μM,15.14μM,21.68μM,13.36μM和28.15μM,且成明显的量效关系。桦木醇作用于肿瘤细胞后,细胞形态发生明显改变。化合物1、2、3、4、5、6、8对5种肿瘤细胞的增殖均未表现出明显的抑制作用。结论：六月青一种三萜类化合物桦木醇对肿瘤细胞有明显的抑制活性。第四部分六月青化学成分对肝星状细胞的影响目的：研究六月青8种化学成分——taraffinisoside A (1)、descaffeoyl crenatoside (2)、deacyl martynoslde (3)、3,4-dihydroxyphenylethanol-8-O-[β-D-apiofuranosyl (1→3)]-β-D-glucopyranoside (4)、hydrangeifolin I (5)、(—)-syringaresinol4-O-β-D-apiofuranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranoside (6)(6R,7S,8S)-7α-[(β-glucopyranosyl)oxy]lyoniresinol (8)和桦木醇(12)的体外抗肝纤维化活性。方法：建立HSC-T6细胞模型,以秋水仙素为阳性对照药,用MTT法从六月青8种化学成分中筛选出具有抑制HSC-T6细胞作用的单体；采用MTT法检测活性单体对大鼠肝正常细胞(BRL)毒性；采用Hoechst33258荧光染色法检测HSC-T6细胞凋亡；采用流式细胞仪PI单染法检测HSC-T6细胞周期。结果：化合物(12)桦木醇对HSC-T6细胞的增殖表现出明显抑制作用,且成明显的量效关系,但对BRL细胞毒性较低；桦木醇能够诱导HSC-T6细胞凋亡并且造成细胞周期S期阻滞；Hoechst33258染色后可以观察到HSC-T6细胞核体积缩小,染色质浓缩,凋亡细胞数随药物浓度增大而增多。结论：六月青一种三萜类化合物桦木醇具有体外抗肝纤维化活性。第五部分六月青化学成分体外抗乙肝病毒研究目的：研究六月青7种化学成分——taraffinisoside A (1)、descaffeoyl crenatoside (2)、deacyl martynoslde (3)、3,4-dihydroxyphenylethanol-8-O-[β-D-apiofuranosyl (1→3)]-β-D-glucopyranoside (4)、hydrangeifolin I (5)、(—)-syringaresinol4-0-β-D-apiofuranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranoside (6)和(6R,7S,8S)-7α-[(β-glucopyranosyl)oxy]lyoniresinol (8)的体外抗乙肝活性。方法：以HepG2.2.15细胞株为模型,采用MTT法检测六月青化学成分对HepG2.2.15细胞的细胞毒作用；用酶联免疫吸附法(ELISA)检测HepG2.2.15细胞上清液乙肝表面抗原(HBsAg)和乙肝e抗原(HBeAg)表达水平。采用实时荧光定量PCR法检测细胞上清液HBV DNA的含量。结果：化合物taraffinisoside (1), descaffeoyl crenatoside (2)和3,4-dihydroxyphenylethanol-8-O-[β-D-apiofuranosyl (1→3)]-β-D-glucopyranoside(4)具有良好的体外抑制HBsAg、HBeAg和HBVDNA分泌的活性。抑制作用随药物浓度的增加而逐渐增强。其中化合物1和2对HBsAg和HBeAg的抑制作用呈明显的时间依赖性。药物干预9天后,化合物1、2和4对细胞分泌HBsAg的IC50分别为0.50、0.72和0.26mM,对细胞分泌HBeAg的IC50分别为0.93、0.42和0.07mM。随着化合物1、2和4浓度的增大,对细胞上清HBV DNA的抑制作用逐渐增强,最大浓度抑制率分别达到94.23%、96.75%和99.47%。结论：通过体外抗乙肝病毒筛选研究证实,六月青化学成分taraffinisoside (1), descaffeoyl crenatoside (2)和3,4-dihydroxyphenylethanol-8-O-[β-D-apiofuranosyl (1→3)]-β-D-glucopyranoside (4)具有一定的体外抗HBV作用。综上所述,我们从六月青中分离得到1个新的苯乙醇苷化合物和18个已知化合物。通过体外实验筛选出一系列具有抗氧化,抗肿瘤,抗肝纤维化和抗乙肝病毒的活性单体成分。