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心脏时刻不停的跳动,而心肌的能量来源大部分依靠脂肪酸的有氧代谢,故需要消耗大量的氧。但冠状动脉和静脉中氧含量差大,心肌通过增加单位体积血液中摄取氧的代偿潜力低。当心脏需氧量增加时,往往主要通过舒张冠状动脉,增加冠脉血流量来满足心脏对氧的需求。对于冠心病病人,其冠脉中存在固定狭窄或其他因素导致的继发冠脉狭窄甚至中断时,心脏的缺氧代偿能力差,较其他器官更容易出现能量生成不足、细胞内外电解质稳态失衡、乳酸中毒,并导致缺氧性损伤。近年来随着我国经济发展,人口高龄化、体力活动减少、肥胖、高脂高热量饮食、糖尿病等冠心病主要危险因素的暴露率增加,冠心病的发病率出现不断上升的趋势,而急性心肌梗死的发生率也随之明显增加。对此如何及时、有效的治疗急性心肌梗死成了降低冠心病的病死率、致残率的关键。目前,对于急性心肌梗死的再灌注治疗方法主要有：①药物溶栓；②介入治疗；③主动脉-冠状动脉旁路移植术。但在临床上经常可看到,罪犯血管开通后,心肌供血得到改善的同时,心肌缺血损伤不但没有减轻却加重的情况,表现为各种心律失常、心肌梗死面积增大、心室收缩功能持续减弱等情况,即心肌缺血再灌注损伤。早年对于缺血再灌注损伤的防治,有以下主张：(1)改善心肌血氧的供求关系。(2)改善再灌注条件。(3)采用外源性自由基清除剂、CCB及细胞保护剂防治再灌注损伤。但以上措施均存在一定的局限性。随后随着细胞保护概念的提出,人们逐渐将研究重点转移到如何启动细胞内源性的保护机制,增加细胞对损伤的抵抗能力。并逐步发展出缺血预处理、缺血后处理、远隔预处理、远隔后处理等概念,但在临床上应用上,上述措施均因其有创性、操作复杂性、与伦理不符而无法为广大医生、患者所接受。对此,我们将目光转向了与缺血再灌注损伤相关的细胞因子,希望通过外源性增加细胞因子浓度,而激活、支持细胞内源性的保护机制,增强心肌细胞对缺氧再灌注损伤的防御能力。心肌营养素-1(CT-1)便是其中一员。Castedo等发现CT-1参与心肌梗死的修复,减轻缺氧复氧引起的心肌细胞损伤,可明显改善左心室收缩功能,降低左心室舒张期僵硬度,增加冠状动脉流量,降低冠状动脉阻力,缩小梗死区面积。Liao等进一步研究发现,对于成年大鼠的原代培养的心肌细胞及离体心脏,无论与缺氧前还是再灌注时给予CT-1,均能明显减少缺氧及缺氧再灌注对心肌细胞带来的损伤。为应对各种应激,人体发展出了一套内源性的保护机制使细胞及组织免于受到损伤,血红素加氧酶-1(H0-1)的上调便是其中一个重要的途径。HO-1又称为热休克蛋白32,是一种微粒体酶,是血红素代谢的起始酶及限速酶。其能氧化降解血红素,并产生一氧化碳,胆绿素及游离的Fe2-,其中胆绿素迅速被还原成胆红素。CO作为一种重要的气体信使分子,能增加细胞内cGMP的水平,发挥扩张血管、抗炎、抑制血小板等作用。胆红素则具有强大的抗氧化、抗炎、抑制血管平滑肌增值等作用。因此,在应激情况下,HO-1过表达能发挥重要的抗氧化应激损伤的作用。心肌的缺血再灌注损伤很大程度是有氧自由基介导的,故上调具有抗氧化作用的HO-1表达有可能大大降低损伤的程度。目前许多研究已证实,HO-1对心血管系统具有保护作用,其适量表达能减轻细胞损伤、蛋白质氧化及脂质过氧化等。目前研究发现CT-1保护心肌的机制是通过减轻细胞调亡的程度实现的,并诱导心肌热体克蛋白hsp70和hsp90的合成起进一步心肌的保护作用。而作用热休克蛋白的一员,HO-1在CT-1的心肌保护作用中是否扮演着重要角色,我们将在以下本实验中探讨。第一章心肌营养素-1拮抗心肌细胞的缺氧再灌注损伤并上调血红素加氧酶-1的表达目的：通过观察不同浓度的CT-1对H9C2大鼠心肌细胞缺氧复氧模型的保护作用及其对HO-1表达的影响,探讨其可能的心肌保护机制。对象和方法：1.1实验对象：H9C2大鼠心肌细胞株1.2实验方法1.2.1实验分组(1)正常对照组(Ctrl组)：细胞用含10%胎牛血清的DMEN-高糖培养基正常培养,不做特殊处理。(2)缺氧复氧组(H2/R24组)：将待处理细胞的培养厌氧培养2h;复氧培养24h。(3)CT-1(5ng/ml)预处理组：用含5ng/m1CT-1的含10%胎牛血清的DMEN-高糖培养基正常培养预培养细胞24h,然后进行上述缺氧/复氧处理。(4)CT-1(10ng/ml)预处理组：用含l0ng/ml CT-1的含10%胎牛血清的DMEN-高糖培养基正常培养预培养细胞24h,然后进行上述缺氧/复氧处理。(5)CT-1(20ng/ml)预处理组：用含20ng/ml CT-1的含10%胎牛血清的DMEN-高糖培养基正常培养预培养细胞24h,然后进行上述缺氧/复氧处理。1.2.2H9C2细胞复苏与培养及缺氧复氧模型建立1.2.3按实验设计处理各组细胞后,酶标仪检测细胞上清的LDH释放率,western blot检测Cleaved Caspase-3蛋白的表达,RT-qPCR检测HO-1mRNA表达,western blot检测HO-1蛋白表达。结果：与H2/R24组比较各浓度CT-1处理组的LDH释放率及Cleaved Caspase-3蛋白表达均显著下降,并存在浓度依赖性。H2/R24组及各CT-1组的HO-1mRNA及蛋白较Ctrl组均升高,而各浓度CT-1处理组升高更明显,且随CT-1浓度升高,HO-1mRNA及蛋白的表达也有所增加。结论：1.CT-1能拮抗H9C2大鼠心肌缺氧复氧损伤,能浓度依赖性的减轻细胞损伤及凋亡。2.CT-1能浓度依赖性的上调HO-1基因的表达,并可能通过HO-1的过表达发挥细胞保护作用。第二章HO-1siRNA抑制HO-1的表达并拮抗CT-1的细胞保护作用目的：通过siRNA干扰的方法抑制HO-1的表达,并观察其对CT-1心肌保护作用的影响。对象和方法：2.1实验对象：H9C2大鼠心肌细胞株2.2实验方法2.2.1实验分组(1)正常对照组(Ctrl组)：转染HO-1siRNA对照片段48h后,细胞用含10%胎牛血清的DMEN-高糖培养基正常培养,不做特殊处理。(2)缺氧复氧组(H2/R24组)：转染HO-1siRNA对照片段48h后,将待处理细胞厌氧培养2h；复氧培养24h。(3)CT-1预处理组(CT-1组)：转染HO-1siRNA对照片段24h后,用含20ng/ml CT-1的含10%胎牛血清的DMEN-高糖培养基正常培养预培养细胞24h,然后进行上述缺氧/复氧处理。(4)HO-1siRNA干扰组(si-HO-1组)：转染HO-1siRNA干扰片段24h后,用含2Ong/ml CT-1的含10%胎牛血清的DMEN-高糖培养基正常培养预培养细胞24h,然后进行上述缺氧/复氧处理。2.2.2设计并合成HO-1siRNA及其对照片段,按照实验设计通过lipofectamine2000进行转染,并作相应实验处理。2.2.3按实验设计处理各组细胞后,RT-qPCR检测HO-1mRNA表达,westernblot检测HO-1蛋白表达,酶标仪检测细胞上清的LDH释放率,western blot检测Cleaved Caspase-3蛋白的表达。结果：si-HO-1组HO-1mRNA及蛋白表达水平与Ctrl组相当,而较H2/R24组及CT-1组则明显减少；而si-HO-1组的LDH释放率、Cleaved Caspase-3蛋白表达较H2/R24组下降,而较CT-1组升高。结论：1.HO-1siRNA干扰能抑制H0-1的表达。2.CT-1能通过上调HO-1的表达而发挥心肌保护作用。全文总结：1.心肌营养素-1具有拮抗心肌细胞缺氧复氧损伤的作用,表现在其能浓度依赖性的减轻心肌细胞缺氧复氧导致的LDH释放、降低Cleaved Caspase-3的表达。2.心肌营养素-1通过上调血红素加氧酶-1表达发挥其抗缺氧复氧损伤作用,表现在心肌营养素-1能浓度依赖的上调血红素加氧酶-1的表达,而通过siRNA干扰血红素加氧酶的表达后,心肌营养素-1的抗缺氧复氧损伤作用被部分拮抗。