论文部分内容阅读
动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是一种动脉壁脂质代谢失衡和免疫应答适应不良而引起的慢性炎症疾病,且具有经典炎症变性、渗出及增生的特点。炎症反应贯穿AS发病的各个阶段,涉及多种炎症细胞、炎性细胞因子、炎性介质、黏附分子、趋化因子、生长因子等。研究表明,促炎因子能够抑制巨噬细胞的胆固醇逆转运作用,促进巨噬细胞细胞泡沫化。因此寻找到具有抗巨噬细胞炎症作用的活性化合物,为治疗AS提供了新的思路。曲林菌素是从海洋真菌Aspergillu sversicolor LZD4403次级代谢产物中提取分离得到的生物活性成分,有报道发现,曲林菌素具有抗真菌和抗炎的活性。本课题组前期研究发现,曲林菌素具有抑制LPS诱导的巨噬细胞泡沫化活性,同时基于其具有抗炎活性,本文在将探讨曲林菌素调节炎症改善巨噬细胞泡沫化的相关作用分子机制,并且考察了该化合物在AS模型动物ApoE-/-小鼠体内的抗AS功效。本文分别采用脂多糖(LPS)及氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导RAW264.7巨噬细胞建立泡沫细胞模型,考察曲林菌素对细胞泡沫化的抑制作用及其分子机制。采用油红O染色测值、甘油三酯、胆固醇含量测定评价曲林菌素对脂质堆积的影响;选择荧光标记法分析曲林菌素对胆固醇流出的影响;RT-PCR检测胆固醇流出相关基因mRNA表达水平,Western blot技术检测胆固醇流出相关蛋白的表达水平。随后,探究曲林菌素抑制巨噬细胞泡沫化与巨噬细胞炎症的关系。通过LPS诱导巨噬细胞产生大量炎症因子,利用,ELISA试剂盒检测曲林菌素的抗炎作用;通过RT-PCR检测与有关巨噬细胞极化状态相关因子的mRNA表达水平。LPS诱导RAW264.7巨噬细胞泡沫化实验结果显示,10 μml/L曲林菌素可以显著抑制LPS诱导的RAW264.7细胞内脂质累计,增强HDL介导的胆固醇流出,表明曲林菌素对于炎症诱导的巨噬细胞泡沫化具有抑制作用。而ox-LDL诱导RAW264.7巨噬细胞泡沫化实验结果显示,曲林菌素对于脂质堆积诱导的巨噬细胞泡沫化没有抑制作用。RT-PCR和Western blot结果表明,曲林菌素显著调节胆固醇流出关键因子(PPAR-Y、ABCG1、ABCA1)的mRNA水平及蛋白表达水平,而对LXR-α的mRNA水平及蛋白表达水平无明显影响,表明曲林菌素并非是直接通过调节巨噬细胞胆固醇流出发挥抗巨噬细胞泡沬化的作用。通过ELISA试剂盒检测曲林菌素对巨噬细胞炎症作用发现,10μmol/L曲林菌素可以显著降低细胞上清中的TNF-α、IL-6与MCP-1水平;同时,RT-PCR检测巨噬细胞极化状态相关因子的mRNA表达水平发现,10μmnol/L曲林菌素也有效抑制了 RAW264.7巨噬细胞iNOS、IL-1β、TNF-α的mRNA水平,有效提高了 IL-10、IL-4的mRNA水平。以上现象表明,曲林菌素可以使M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化从而发挥抗巨噬细泡沫化的作用。在体内药效学研究中,选用自发产生AS斑块的ApoE-/-小鼠这一实验动物模型,对曲林菌素抗AS的体内活性进行初步的探究。使用高胆固醇饲料喂养ApoE-/-小鼠,同时灌胃给药曲林菌素12周。第12周时利用小动物超声影像系统检测主动脉部位血管管腔直径;12周后,取血并解剖小鼠,利用解剖显微镜观察AS斑块大小并拍照;利用全自动生化分析仪与ELISA试剂盒分别检测小鼠血脂水平及血清炎症因子水平。实验结果发现,连续口服灌胃给药曲林菌素12周后,ApoE-/-小鼠的斑块面积明显减小,主动脉管腔的狭窄也被明显抑制。ELISA试剂盒检测发现,曲林菌素有效地降低了 ApoE-/-小鼠血清炎性因子水平,但是对ApoE-/-小鼠血清中总胆固醇的含量没有产生明显影响,以上现象表明,曲林菌素并非是通过降低ApoE-/-小鼠胆固醇水平,而是通过抑制小鼠机体炎症而发挥抗AS功效的。综上所述:本研究首次证实,海洋天然产物曲林菌素可以通过抑制巨噬细胞炎症,进而发挥抑制巨噬细胞泡沫化作用;曲林菌素在体内还表现出抗AS功效,但其主要是通过抑制机体炎症的产生而非改善血脂异常发挥功效的。以上实验结果为曲林菌素防治AS提供了研究依据。