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苔藓植物是一类以孢子繁殖,由水生向陆生、低等向高等过渡的重要植物类群,其分布非常广泛。因大多数苔藓植物的生长环境都相对比较恶劣,从而使得其体内产生了极为丰富的次级代谢产物,这些次级代谢产物具有各种各样的生物活性,可以作为新药开发的先导化合物,因此被称为是生物活性物质的源泉。萜类,联苄类和黄酮类化合物是苔藓植物中的主要次生代谢产物。黄酮类化合物广泛存在于植物中,是一类低分子量的多酚类化学物质。在一些药用植物中,黄酮类化合物是主要的药用成分,而且在很多水果、蔬菜和饮料中也存在各种各样的黄酮类化合物。植物体内存在的黄酮类化合物能够对植物的生长发育起到调节控制作用,还能够抵抗外界的非生物胁迫以及昆虫侵袭等。另外黄酮类化合物还具有抗炎、抗菌、抗过敏、抗氧化以及抗癌等生物活性。其生物合成途径在高等植物中已经得到广泛而深入的研究,证明黄酮类化合物来自于苯丙烷和丙二酸生物合成途径。然而由于缺少基因组信息,苔类植物黄酮类化合物生物合成途径研究较少。本实验室前期构建了钝鳞紫背苔的cDNA文库,并进行了EST测序,也对粗裂地钱进行了转录组测序,本文分别从两种苔的数据库中寻找到两个与查尔酮异构酶(chalcone isomerase, CHI)具有较高同源性的基因,分别命名为PaCHI1, PaCHI2, MpaCHI1和MpaCH12、将它们构建入原核表达载体并诱导纯化蛋白,进行体外酶活功能鉴定,同时对以柚皮素查尔酮为底物的酶活产物进行手性分析来鉴定查尔酮异构酶的立体选择性。酶活结果显示PaCHI1和MpaCHI1能够催化柚皮素查尔酮和异甘草素转变成相应的产物柚皮素和甘草素,这是第一次从非豆科植物中发现type Ⅱ查尔酮异构酶,而PaCHI2及MpaCHI2没有催化活性。进化树分析显示PaCHI12和MpaCHI2与type Ⅳ查尔酮异构酶(CHI-like)归为一簇,而PaCHI1和MpaCHIl与type Ⅰ, type Ⅱ查尔酮异构酶归为一类,但从进化关系上看,PaCHIl和MpaCHIl与type Ⅱ查尔酮异构酶更为接近。酶活产物手性分析显示PaCHIl和MpaCHIl具有立体选择性,能够选择性生成2S构型的黄酮。黄酮合酶在类黄酮的生物合成途径中也是至关重要的酶。本文从钝鳞紫背苔的cDNA文库中筛选得到一个与黄酮合酶Ⅰ同源性较高的基因,命名为PaFNS Ⅰ,通过5’-RACE获得该基因的全长,并构建原核表达载体,对获得的重组蛋白进行体外酶活功能鉴定。以柚皮素为底物的酶活结果显示：该蛋白能够催化柚皮素生成2-羟基柚皮素和芹菜素,说明该蛋白同时具有F2H (flavanone 2-hydroxylase)和FNS (flavone synthase)的功能。以二氢山萘酚为底物的酶活分析结果显示该蛋白具有微弱的黄酮醇合酶(FLS)功能；而对圣草酚、二氢槲皮素没有表现出任何催化活性。通过氨基酸序列比对以及蛋白结构同源模拟,我们最终确定4个关键氨基酸Ala120,Phe146,Tyr240和Leu311,将它们分别突变成：Met120, Ile146, Pro240和Phe311,突变体酶活结果显示将Y240突变成P240后,酶活产物只有芹菜素,没有2-羟基柚皮素的生成,推测是因为Tyr240的苯环与柚皮素的A环形成一个疏水的π-π；堆积作用,该作用如果被破坏则阻碍了2-羟基柚皮素的生成；又将Y240突变成Ala, Val,Ile和Phe,另外将Ala120,Phel46,Tyr240和Leu311四个突变位点进行组合突变,最终综合分析所有突变体的酶活,结果确定Y240是2-羟基柚皮素形成的关键氨基酸。本文是第一次报道黄酮合酶Ⅰ (FNS Ⅰ)具有黄酮2位羟化的活性,并且寻找到决定产物比例的关键氨基酸。