前言：2型糖尿病(T2DM)是包括遗传及环境等多种因素相互作用的结果。传统的药物及胰岛素治疗不能延缓糖尿病并发症出现的时间及疾病的进程。　　 Walter首次发现减肥手术可以治疗糖尿病这一现象。据Wickremesekera报道T2DM血糖可在术后几天至几周内缓解。RYGB是一种减肥手术,其中绕过了80-90％的胃体,患者将减少60-90％额外的体重和获得良好的血糖控制,这种作用可以维持15年以上。　　 既往认为胃容积减少及营养吸收不良引起体重减轻对血糖控制起到重要作用,但是营养不良的指标如白蛋白、前白蛋白粪内脂类并未增加。一些研究表明在体重有效减轻之前T2DM已得到有效控制。目前认为体重减轻和血糖控制与体内内分泌激素变化有关,RYGB术后观察到胰高血糖素样肽-1(GLP-1)、肽YY(PYY)、脂联素、ghrelin等均升高。然而,该手术降糖及控制体重的确切机制尚未完全清楚。　　 脂联素由脂肪细胞产生和分泌,具有减轻胰岛素抵抗、抗动脉粥样硬化、抗炎等多种生物学活性。研究发现脂联素受体1(AdipoR1)和受体2(AdipoR2)均在胰岛细胞中表达,并以AdipoR1表达为主。研究表明在中心性肥胖及T2DM中脂联素水平下降。脂联素水平与HOMA-IR值、总胆固醇水平、低密度脂蛋白、甘油三酯、血压、BMI成负相关。脂联素转基因鼠表现出胰岛素抵抗缓解和抗动脉粥样硬化作用。脂联素基因敲除小鼠表现出高血糖,注射脂联素后可消除高血糖并呈剂量依赖关系。　　 RYGB在控制血糖机制方面没有完全阐述清楚。本研究目的在于观测RYGB是否具有减少胰岛细胞凋亡的作用及脂联素在RYGB手术中所起的降糖作用。目前脂联素是否影响胰岛素分泌及对高糖诱导的胰岛B细胞凋亡是否具有保护作用存在争议,RIN-m5f细胞系是能够分泌胰岛素的小鼠胰岛细胞系,本研究应用RIN-m5f细胞系观察脂联素球状结构域(gAd)是否具有促进胰岛素分泌作用,对高糖诱导的细胞凋亡是否有保护作用,并解释其分子机制。　　 材料及方法：　　 一、动物实验　　 (一)20只10周龄雄性Goto-Kakizaki(GK)大鼠(一种自发糖尿病鼠),随机分到RYGB组(10)和GK组(10)。10周龄Wistar大鼠分配到WS组(10)。饲养环境室温26±1℃,相对湿度45％,自然光照明,术前至少10天单笼饲养。　　 (二)RYGB组动物行胃旁路手术,保留贲门附近约20％胃体,保留迷走神经,距Treitz韧带10cm断空肠,远端上提与残胃吻合,距吻合口10cm行空肠近端与空肠端侧吻合。GK组及WS组大鼠为假手术组,胃前壁切开7mm切口,并原位缝合。控制手术时间与RYGB组相同。　　 (三)检测　　 1、术前3天、术后7、14、21、28天测定动物体重及每100克体重摄食量。　　 2、术前、术后30天各测定空腹血糖(FBS)1次。　　 3、术前2天和术后30天各测定一次OGTT。大鼠禁食12 h,一次性灌胃给予50％葡萄糖(2 g/Kg体重)。尾静脉穿刺法采血,血糖仪法测定血糖值。采血时间点分别为0、30、60、90、120 min。用血糖曲线下面积(AUC)评价OGTT。　　 4、术前2天和术后30天分别检测一次餐前及餐后胰岛素、C-肽及脂联素水平(ELISA)。　　 二、细胞部分　　 (一)Annexin V-FITC/PI双染检测检测细胞凋亡将大鼠胰岛细胞系RIN-m5f分为normal、glucose、A0.2、A2、A20组。分别于A0.2、A2、A20组分别加入gAd至0.2、2、20μg/ml作用细胞,各组培养12h后,于glucose、A0.2、A2、A20组分别给予高糖至33.3mM,培养12h后应用Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡。　　 (二)gAd对RIN.m5f细胞胰岛素分泌的测定　　 1、根据培养基中gAd浓度不同,分为A0、A0.2、A2、A20μg/ml组,经gAd作用12h后ELISA法检测胰岛素水平。　　 2、将gAd浓度调整为2μg/ml,分别于培养后2、6、12、24h后ELISA法检测胰岛素水平。　　 (三)gAd对胰岛素分泌影响的分子机制实验设为正常组(C)及gAd浓度2gg/ml组(A)。将细胞培养12h,收集细胞,免疫蛋白印迹(Western blot)法检测胰岛素、AMPK及AdipoR1及Real-timequantitative PCR测定上述指标。　　 (四)AdipoR1 siRNA转染后对胰岛素表达的影响将细胞经siRNA AdipoR1转染后,检测转染效率及免疫蛋白印迹(Westernblot)法检测胰岛素。　　 (五)gAd对高糖诱导的RIN-m5f细胞凋亡的保护作用实验设为三组:正常组(C)、高糖组(G)及gAd保护组(A)组。A组加gAd调整浓度至2μg/ml,共同培养12h后,在G、A组加入葡萄糖至浓度为33.3mM,12h后收集细胞W-B及Real-time quantitative PCR法检测PKC、BAD、Bcl-xL及AdipoR1。　　 三、统计学处理所有数据用(x)+SD表示,用SPSS11.5分析软件处理,并应用单因素方差分析、Studentt-test及Tukeys test处理数据。P＜0.05有统计学意义。　　 结果：　　 一、手术结果　　 RYGB组大鼠术后2只吻合口梗阻死亡,GK组术后因切口感染死亡1只,WS假手术组无死亡。　　 二、术后大鼠体重变化术前RYGB、GK及WS组组间体重无显著性差异(P＞0.05)。术后1周时,术后各组大鼠体重均有不同程度降低,术后3周时体重有所增加,并维持在该水平。RYGB组降低明显与其他两组有统计学意义(P＜0.01)。GK组术后28天时体重比WS组降低明显,但无统计学意义。　　 三、术后摄食率的变化术前各组间摄食率无显著性差异(P＞0.05)。术后RYGB组摄食率明显下降,21天时有上升趋势,但仍低于其他两组,差异有统计学意义。　　 四、术前、术后空腹血糖(FBS)的变化术前RYGB组、GK组FBS水平明显高于WS组,差异具有显著性(P均＜0.01)。术后30天时RYBG组FBS值已基本降至正常范围,并与WS组无显著性差异。　　 五、术后口服葡萄糖耐量的变化术前RYGB组、GK组OGTT曲线下面积(area under curve,AUC)值显著大于对照组(P均＜0.05)。术后30天时,RYGB组AUC值显著降低,与WS组无差异显著性。　　 六、术后血浆胰岛素的变化术前RYGB组、GK组大鼠基础餐前血浆胰岛素水平并不低于正常对照组(P＞0.05)。而餐后RYGB组及GK组大鼠血浆胰岛素明显低于WS组(P＜0.01)。术后各组基础血浆胰岛素水平较术前无明显下降变化,各组间无统计学差异。术后RYGB组餐后胰岛素与GK组相比有明显升高。　　 七、RYGB手术对胰岛素抵抗的影响术前RYGB组、GK组HOMA-IR值均显著高于WS组,表明术前GK大鼠存在明显的胰岛素抵抗,差异有统计学意义(P均＜0.05)。术后RYGB组HOMA-IR值明显降低,并与WS组HOMA-IR值无明显差异(P＞0.05),而该两组HOMA-IR值明显低于WS组,有显著性差异(P＜0.01)。　　 八、血浆C-肽测定术前RYGB组、GK组C-肽值显著低于对照组(P均＜0.01)。术后30天时,RYGB组C-肽值显著高于GK组(P＜0.01)。　　 九、血清脂联素水平测定RYGB组及GK组脂联素水平显著低于对照组。术后30天时,RYGB组脂联素升高至正常水平,显著高于GK组(P＜0.01)。　　 十、术后胰岛TUNEL细胞凋亡检测术后30天时,RYGB组(2.85±0.26％)及WS组(2.92±0.21％)凋亡指数显著低于GK组(16.38±0.45％),GK组可以看到更多的凋亡细胞。　　 十一、透射电镜结果GK组可以观察到更多典型的凋亡细胞,细胞核不规则,染色质凝集、边聚。　　 十二、Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测glucose组凋亡指数(16.85±1.40％)明显高于其他各组(P＜0.01)。脂联素对高糖诱导的细胞凋亡有保护作用,并随着浓度增加保护作用增强。　　 十三、gAd对RIN-m5f细胞胰岛素分泌的影响随着各组gAd浓度的增加,胰岛素分泌量有所增加,各组差异有显著性。当gAd浓度为2μg/L,随时间的延长,胰岛素分泌量增加,差异有显著性,12h时达到高峰。　　 十四、gAd对RIN-m5f细胞胰岛素分泌影响分子机制gAd作用后,Real-time quantitative PCR及W-B结果显示:A组AdipoR1表达上调,差异有显著性;胰岛素表达增加,差异有显著性(P＜0.01),AMPK表达无明显差异(P＞0.05)。　　 十五、siRNAA干扰AdipoR1后对胰岛素表达的影响AdipoR1 siRNA转染后,AdipoR1表达量下降80％(P＜0.01)。胰岛素表达下降为0.45±0.09(P＜0.01)。　　 十六、gAd对高糖诱导的RIN-m5f细胞凋亡的保护作用Real-time quantitative PCR及W-B结果显示A组AdipoR1表达量较其它两组升高。PKC在A组比C组表达量增加,而G组比A、C两组表达量均降低。A组BAD比C、G组表达量下降,C组表达量较A组增加。Bcl-xL在A组比C组表达量增加,G组比A、C两组表达量均降低。　　 结论：　　 1、RYGB具有治疗T2DM作用。　　 2、RYGB术后餐后胰岛素升高是良好控制血糖的原因之一。　　 3、RYGB术后可以通过减少凋亡对T2DM胰岛细胞起保护作用。　　 4、RYGB术后升高的脂联素可能对控制血糖及减少胰岛细胞凋亡发挥重作用。　　 5、gAd可以通过与AdipoR1结合引起胰岛素分泌,并有时间及剂量依赖关系,该过程与AMPK表达无关。　　 6、gAd对高糖引起的胰岛细胞凋亡有保护作用,并有剂量依赖关系。　　 7、gAd可以通过激活PKC→BAD→Bcl-xL线粒体通路减少胰岛细胞凋亡。