研究背景乳腺癌(carcinoma of breast)是全球女性最常见的恶性肿瘤之一,据世界卫生组织国际癌症研究中心(International Agency for Research on Cancer, IARC)统计,2012年女性乳腺癌新发病例高达170万,占全部女性恶性肿瘤发病的22.9%,每年因乳腺癌死亡的女性约52.1万,占所有女性恶性肿瘤死亡的13.7%。乳腺癌发病年龄逐渐年轻化,已跃居为女性恶性肿瘤发病率的首位,严重威胁女性的生命健康。目前乳腺癌的主要治疗方式包括手术、化疗、放疗、内分泌治疗及靶向治疗,随着早期诊断与综合治疗的发展,乳腺癌的病死率已经逐渐下降。然而,即便强化治疗后仍有较多患者发生肿瘤复发与转移。近年来,越来越多的研究关注于肿瘤微环境和宿主的关系,有关肿瘤免疫治疗的新思路、新方法、新策略不断涌现,免疫治疗成为乳腺癌治疗研究中最为活跃的领域,是一种能潜在提高乳腺癌患者预后的治疗方案。其中,开发研究新型有效的肿瘤疫苗仍然是当前肿瘤免疫治疗的重要方向和热点之一。研究者发现,特定作用条件下诱导的衰老肿瘤细胞(senescent tumor cells, STC)能够保持活性,表达分泌多种免疫刺激因子和趋化因子,并改变了肿瘤细胞与免疫耐受相关的生物学特性。STC能持续吸引DC、巨噬细胞和淋巴细胞浸润,诱导DC成熟与活化增殖,继而CD4+辅助和CD8+杀伤T细胞也可迁移到接种部位,聚集和激活更多的DC前体和巨噬细胞,释放更高水平的TNFα、IFNγ等免疫因子,进一步启动全身免疫反应。由于STC对肿瘤的发生发展能起到高效预防作用,衰老肿瘤细胞作为新型肿瘤疫苗也受到越来越多的关注。细胞衰老是指细胞从一个具有活性的增殖状态进入不可逆转的生长停滞状态,端粒的缩短、氧化应激的压力、DNA损伤、癌基因的激活以及抑癌基因的失活都能诱导细胞衰老,进而发生一系列形态学与代谢变化。肿瘤细胞虽然具有无限增殖的永生化能力,但在一定作用条件下(如化疗药物、电离辐射、促分化剂以及遗传学操作等)可以被诱导进入衰老状态,被称为加速性衰老(accelerated senescence),即早衰(premature senescence). STC表现出不同于肿瘤细胞的衰老细胞所具有的形态和代谢特征,如细胞停止生长,体积变大、变扁平、颗粒增多,产生pH值为6时仍具有较高活性的衰老相关β-半乳糖苷酶(senescence-associated β-galactosidase, SA-β-gal).衰老细胞处于增殖停滞的存活状态,能够分泌多种生长因子和炎性细胞因子作用于周围环境,即衰老相关分泌表型(senescence-associated secretory phenotype,SASP),SASP在衰老细胞中普遍表达,且不用细胞成分有所不同。SASP具有双向调节作用,主要依赖于其所处的生物环境。肿瘤细胞在化疗药物或者电离辐射的作用下进入衰老状态,在一些小鼠模型中能够起到促进免疫系统清除肿瘤细胞、抑制肿瘤生长的作用。近来研究发现,特定作用条件下诱导的衰老肿瘤细胞能够产生具有免疫刺激作用的SASP,聚集并激活更多的免疫效应细胞,形成具有免疫正向作用的环境,促进肿瘤细胞的免疫清除。现有研究发现多聚二磷酸腺苷核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase, PARP)抑制剂与放疗结合能够诱导持续的DNA双链断裂,加速肿瘤细胞衰老,即产生应激性过早衰老,这为我们制备衰老肿瘤细胞提供了新的方法和思路。IR使肿瘤细胞出现DNA损伤,作为PARP抑制剂的veliparib能够抑制DNA损伤修复,使损伤持续和染色质聚集,促进细胞衰老。经过R处理的黑色素瘤细胞注射到小鼠体表,可引起注射部位巨噬细胞、淋巴细胞和DC的浸润。而经过veliparib与IR双重诱导的STC较单独IR的肿瘤细胞引起回流淋巴结(draining lymph nodes,DLNs)产生更高水平的IFN-γ,且尚存活的STC能够在注射部位分泌多种免疫因子,能持续吸引更多的巨噬细胞、淋巴细胞和DC。最近研究发现,经过IR处理的肿瘤细胞除了细胞表面MHC-I表达增强外,还能产生新的抗原肽以及危险信号分子(如ATP、HMGB1),产生继发性免疫反应。在接种部位可出现APC抗原提呈反应,并诱导DC的成熟与活化增殖,激活的T细胞也可迁移到接种部位,招募和激活更多的巨噬细胞和DC前体,释放大量免疫因子,进一步启动全身的抗肿瘤免疫反应,高效率地预防肿瘤的发生发展。乳腺癌细胞的免疫原性较弱,传统的肿瘤疫苗常常不能激发有效的免疫反应。我们尝试采用PARP抑制剂veliparib与X射线联合诱导乳腺癌STC,将经过照射的肿瘤细胞转换为具有更强免疫刺激效应的活性衰老细胞,建立一个能高效预防乳腺癌发生发展的衰老肿瘤细胞模型。研究目的1.通过X射线照射联合veliparib诱导小鼠乳腺癌细胞株4T1衰老,检测衰老相关p-半乳糖苷酶的表达及衰老细胞比例观察细胞衰老效果,以确定建立衰老4T1模型的合适作用剂量及时间。2.通过RT-PCR、CBA等检测衰老乳腺癌细胞株4T1的SASP,观察其特点,并观察小鼠注射衰老4T细胞后接种正常4T1的生存期,以初步探讨衰老4T1疫苗对乳腺癌的发生发展的预防作用。研究方法与内容1.诱导衰老肿瘤细胞：将小鼠乳腺癌细胞株4T1分为四组进行实验操作,即对照组(不加任何处理因素)、Vel组(在细胞接种23h后换用含veliparib的培养液)、X射线组(单纯用X射线照射)、X射线+Vel组(在接种后23h即照射前1h换用含veliparib的培养液)。X射线组与X射线+Vel组分别设置6Gy、9Gy、12 Gy三个照射剂量,采用美国Varian2100直线加速器照射细胞。2.检测衰老肿瘤细胞：取照射后第2天及第4天的细胞进行SA-β-gal活性检测,计算并比较四组细胞的SA-β-gal阳性细胞率,对比6Gy、9Gy、12Gy三个剂量组的SA-β-gal阳性细胞率并选取合适的剂量；收集照射后第4天的细胞,根据细胞体积大小及颗粒多少用流式细胞仪进行分群,检测衰老肿瘤细胞的比例。3.检测SASP:收集X射线+Vel联合处理后第1、2、4、6、8天的细胞及培养至第4天的对照组、Vel组、X射线组细胞,运用RT-qPCR检测各组p21、IFN-β、 TNF-α、CCL2、CCL5、CXCL9、CXCL10mRNA的表达情况,观察X射线+Vel组细胞因子表达随时间的动态变化；采用多重液相蛋白定量技术(Cytometric Beads Array,CBA)检测细胞分泌的TNF-α、IFN-β、IFN-yγ;分别检测流式分选出的衰老细胞、非衰老细胞的分泌表型。4.衰老4T1细胞疫苗对小鼠乳腺癌的预防：通过对小鼠先注射STC再接种肿瘤细胞,探讨X射线照射联合veliparib诱导的乳腺癌STC对肿瘤的预防作用。研究结果1.细胞处理后第2天,对照组与Vel组4T1细胞形态正常、数目明显增多；X射线组细胞形态稍改变,而X射线+Vel组细胞已发生明显的形态改变,增殖减慢。照射后第4天,X射线+Vel组细胞形态更不规则,细胞变扁平、颗粒增多,核浆比例减小,细胞数较前无明显增多。2.处理后第4天,对照组、Vel组、9Gy组、9Gy+Vel组细胞的SA-β-gal阳性率对比：Vel组与对照组的差异无统计学意义(P=0.768),9Gy组与对照组差异有显著统计学意义(P<0.001);9Gy+Vel组阳性率最高,与其他组相比差异均具有统计学意义(P<0.001)。不同照射剂量的比较：在相同药物浓度、不同照射剂量作用下,剂量越高,SA-β-gal阳性细胞率越高。6Gy+Vel组与9Gy+Vel组相比,差异有统计学意义(P=0.002); 12Gy+Vel组阳性率明显高于6Gy+Vel组(P<0.001)与9Gy+Vel组(P=0.035)。3.经过流式检测,对比各组衰老肿瘤细胞的比例：Vel组与对照组相比,差异无统计学意义(P=0.942)；9Gy组与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.001)；9Gy+Vel组的衰老肿瘤细胞比例最高,与其他组相比差异均具有统计学意义(P<0.001)。4. p21、IFN-β、TNF-α mRNA表达量的对比中,均为9Gy+Vel组的最高。比较各组细胞p21mRNA的表达量：Vel组与对照组差异无统计学意义(P=0.726),9Gy组与对照组对比差异有统计学意义(P=0.001),9Gy+Vel组与其他组相比差异具有统计学意义(P<0.001)。各组IFN-β mRNA的表达量：Vel组与对照组差异无统计学意义(P=0.985),9Gy组与对照组对比差异有统计学意义(P=0.023),而9Gy+Vel组明显高于其他组(P<0.001)。各组TNF-α表达量：Vel组与对照组差异无统计学意义(P--0.966),9Gy组与对照组对比差异有统计学意义(P=0.001),9Gy+Vel组与其他组相比差异具有统计学意义(P<0.001)。在趋化因子CXCL9、CXCL10、CCL2、CCL5的表达方面,均为9Gy+Vel组的最高,9Gy+Vel组上述趋化因子的表达均明显高于对照组(P<0.001)、Vel组(P<0.001)与9Gy组(P<0.001)。药物与X射线联合处理后,细胞的IFN-β、 TNF-α、CXCL9、CXCL10、CCL2、CCL5表达量均随时间发生变化,在照射后第4天出现高峰,之后逐渐下降。5.CBA检测细胞因子TNF-α、IFN-β、IFN-γ的分泌水平,均为9Gy+Vel组细胞上清液的浓度最高。对比各组细胞上清液细胞因子的浓度,9Gy+Vel组均明显高于对照组(P<0.001)、Vel组(P<0.001)与9Gy组(P<0.001)。6.对比衰老4T1细胞与非衰老细胞p21及各细胞因子的表达量,衰老细胞的p21(P=0.017)、TNF-α(P=0.001)、IFN-β(P=0.001)、CXCL9(P=0.010)、 CXCL10 (P=0.008)、CCL2(P=0.005)、CCL5(P=0.005)表达量均高于非衰老4T1细胞。7.右腿接种Vel组细胞或者无接种细胞的小鼠均在接种4T1细胞后均有肿瘤生长,9Gy组未发生肿瘤小鼠的比例约为22.22%,而9Gy+Vel组小鼠的比例约为77.78%。对比接种4T1细胞后第20天各组未发生肿瘤小鼠的比例,四组间差异具有统计学意义(P=0.013),以注射联合处理组细胞的未长肿瘤小鼠的比例最高。研究结论1. Veliparib联合X射线能显著加速小鼠乳腺癌细胞株4T1衰老,衰老不是在应激后立即出现,需要把握合适的时间点有效利用衰老肿瘤细胞。2. Veliparib联合X射线诱导的衰老肿瘤细胞具有特征性SASP,其分泌随时间发生动态变化,veliparib与X射线处理后细胞的SASP主要来自于衰老肿瘤细胞,选择处于分泌高峰的衰老肿瘤细胞作为肿瘤疫苗更能突出其作用。3. Veliparib与X射线联合处理的衰老4T1能够有效预防肿瘤的形成。