松茸化学组分、多糖结构表征及抗肿瘤活性研究

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真菌已经对人类的生活产生了几千年的影响,无论是作为食物来源,还是作为药品,真菌的营养价值和药用价值早已被世界所认可。研究表明,许多真菌都具有抗肿瘤、增强机体免疫功能、降糖、降脂、降压和防治冠心病等多种生物活性。松茸(Tricholoma matsutake Sing.)是世界上稀有名贵的野生食用菌,分布在非洲、美洲、欧洲和亚洲的许多地区,除了味道鲜美,其提取物具有增强免疫、抗肿瘤、降低胆固醇,抗氧化等生物活性。本文研究了松茸的化学组成,并对其多糖的分离纯化、理化性质、结构表征及体外抗肿瘤活性进行了初步研究。在第一部分中,通过常规的分析方法测定了松茸的基本化学组成,包括粗蛋白、粗纤维、粗脂肪、碳水化合物、灰分和矿物元素;对松茸中氨基酸和脂肪酸的种类和含量进行了研究,系统地评价了其营养价值。结果显示,在松茸中粗蛋白(20.3%),粗纤维(29.10%)和碳水化合物(36.67%)的含量丰富;粗脂肪含量较低(5.04%),但是其中油酸和亚油酸含量超过脂肪酸的75%。松茸中必需氨基酸的含量占总氨基酸的34.65%,与FAO/WHO提出的理想蛋白模式接近;第一限制氨基酸为蛋氨酸;其氨基酸比值系数分高达80.16。此外松茸中还含有丰富的矿物质。研究结果表明,松茸是一种对人类健康具有特殊贡献的良好的保健营养植物。第二部分对多糖的提取、分离、纯化工艺进行了优化。实验通过苯酚-硫酸法检测多糖含量,以考马斯亮蓝法检测蛋白质含量。采用传统的水提醇沉法,以多糖得率为指标,通过单因素实验和正交实验,考察了提取时间、提取温度、提取次数以及液料比等工艺参数;以多糖醇沉得率为考察指标,优化了醇沉工艺;以多糖损失率和脱蛋白率为考察指标,优化了脱蛋白工艺;以脱色前后溶液颜色的改变和多糖损失率为考察指标,优化了脱色工艺。实验还通过D101大孔吸附树酯和Sephadex G-100凝胶滤过色谱对松茸多糖进行了分离纯化,建立了松茸多糖的最佳提取、分离和纯化工艺,最终得到3个松茸多糖MTS-1、MTS-2、MTS-3。第三部分研究了松茸多糖的理化性质和结构表征。实验采用间羟联苯法和硫酸钡浊度法测定了3个多糖的糖醛酸含量及硫酸根含量;通过自动旋光仪和元素分析仪测定了多糖的比旋光度和C、H元素组成比例;运用高效凝胶渗透色谱(HPGPC)对多糖的纯度和分子量进行了分析和测定;多糖经酸水解、三甲基硅醚衍生化后,通过气相色谱(GC)分析了其中的单糖组成;结合紫外-可见光谱(UV-VIS)、傅立叶红外光谱(FTIR)、电喷雾飞行时间质谱(ESI-TOF-MS)、一维及二维核磁共振光谱(NMR)等数据分析了多糖的结构表征。分析结果表明MTS-1、MTS-2、MTS-3为纯多糖,平均分子量分别为5939、180357、232372。MTS-1主要由葡萄糖组成,含有少量的木糖和半乳糖,葡萄糖、木糖、半乳糖的摩尔比为12.89:1.20:1。MTS-2同样是由葡聚糖、木糖和半乳糖组成,摩尔比为16.77:1.63:1;结合波谱数据综合分析,推断MTS-2是以α-D-葡萄糖通过1→6糖苷键连接的葡聚糖为主链,含有少量的α-D-木糖和β-D-半乳糖,可能位于侧链,也可能杂合于主链中。MTS-3是由葡萄糖聚合而成的均多糖,结合波谱数据综合分析,确定MTS-3为β-D-葡萄糖通过1→6连接聚合而成的直链葡聚糖,聚合度约为36~37,其结构式如下。第四部分采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法结合显微镜下细胞形态学观察的方法,研究了松茸多糖的体外抗肿瘤活性。实验考察了不同浓度的松茸多糖作用不同时间对人舌癌细胞Tca8113、人肝癌细胞HepG-2、人胰腺癌细胞HS766T、人宫颈癌细胞Hela、人乳腺癌细胞MCF-7的增殖抑制作用。结果表明,松茸多糖在低浓度时对HepG-2、HS766T的生长影响较小,但对Tca8113、Hela;和MCF-7的抑制作用明显,随着浓度升高对5种肿瘤细胞的抑制作用都随之增强,并呈现出一定的量效关系,在100μg·mL-1作用72h对上述5种肿瘤细胞最大抑制率分别为67.71%,74.89%,83.83%,75.57%,76.15%。从细胞形态学上观察,松茸多糖对上述5种肿瘤细胞均能引起不同程度的细胞凋亡,其作用机理有待进一步深入研究。整个实验研究了松茸基本化学组成,多糖的提取分离纯化工艺优化,多糖的理化性质和结构表征,还对松茸多糖的抗肿瘤活性进行了初步研究。本论文对松茸系统的研究,为该稀有珍贵的食药用真菌的进一步开发利用提供了理论依据。
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