论文部分内容阅读
目的酒精性肝病是全球关注的重要公共卫生问题。酒精性脂肪肝是其初期表现，主要表现为肝脏中脂质过度沉积。最近的研究证实，在酒精性脂肪肝发病过程中脂肪酸和甘油三酯合成增加是肝脏脂质过度沉积的主要原因。而固醇调节元件结合蛋白（SREBP）-1是脂质合成的重要转录调节因子，在酒精性脂肪肝发病过程中起重要作用。研究也发现急性酒精暴露诱导肝脏SREBP-1激活和肝脏脂质沉积。另一方面，Toll样受体（TLR）4在慢性酒精性脂肪肝中起重要作用已被证实，但在急性酒精性脂肪肝中的作用尚不明确。本研究重点探讨TLR4是否通过影响活性氧和炎性细胞因子的产生，继而介导急性酒精对肝脏SREBP-1激活作用，促进肝脏脂质合成和脂质沉积导致急性酒精性脂肪肝。方法本研究由四个实验构成。实验一、探讨TLR4在单剂量酒精暴露诱发小鼠肝脏SREBP-1c激活和脂质沉积过程中的作用。将雄性ICR(TLR4+/+)、C3H/HeN(TLR4+/+)和C3H/HeJ(TLR4-/-)小鼠各12只分别随机分成酒精处理组和对照组，所有小鼠禁食2h后，酒精处理组小鼠单次灌胃给予4g/kg酒精，对照组小鼠灌胃给予等容量生理盐水，给予酒精12h后剖杀。取血清检测甘油三酯（TG）及其脂质代谢相关指标含量；称量肝重，计算肝重/体重比；取肝脏组织制备冰冻切片用于油红O染色，观察小鼠肝脏组织脂质沉积情况；其它肝脏组织-80°C保存，用qPCR技术检测调控肝脏脂肪酸和TG合成关键转录因子SREBP-1c下游靶基因fas,acc,scd-1,dgat-2mRNA水平，用TG检测试剂盒检测小鼠肝脏组织TG含量。为进一步深入研究单次酒精暴露对小鼠肝脏SREBP-1c的动态影响，将雄性ICR(TLR4+/+)、C3H/HeN(TLR4+/+)和C3H/HeJ(TLR4-/-)小鼠各20只随机分为5组：对照组、酒精处理0.5h组、酒精处理2h组、酒精处理6h组和酒精处理12h组。实验中所有小鼠均禁食，酒精处理（0.5h、2h、6h和12h）各时点组小鼠分别在禁食（13.5h、12h、8h和2h）后灌胃给予酒精（4g/kg），对照组灌胃给予等容量生理盐水。所有小鼠禁食14h后剖杀，取肝脏组织用Westernblot技术检测单剂量酒精暴露对小鼠肝脏SREBP-1c核蛋白水平的影响。实验二、为研究单剂量酒精暴露是否激活肝脏PI3K/Akt信号。将12只雄性TLR4+/+小鼠随机分成酒精处理组和对照组，所有小鼠禁食8h后，酒精处理组小鼠单次灌胃给予4g/kg酒精，对照组小鼠灌胃给予等容量生理盐水，给予酒精6h后剖杀。取血清测定胰岛素和葡萄糖水平，取肝脏组织-80°C保存用qPCR技术检测肝脏irs-1和irs-2mRNA水平。取雄性TLR4+/+和TLR4-/-小鼠各20只，随机分为5组：对照组、酒精处理0.5h组、酒精处理2h组、酒精处理6h组和酒精处理12h组。酒精处理（0.5h、2h、6h和12h）各时点组小鼠分别在禁食（13.5h、12h、8h和2h）后灌胃给予酒精（4g/kg），对照组灌胃给予等容量生理盐水。所有小鼠禁食14h后剖杀，取肝脏组织用Westernblot技术检测单剂量酒精暴露对小鼠肝脏Akt蛋白表达和磷酸化水平的影响。实验三、为探讨单剂量酒精暴露对小鼠肝脏TLR4信号的影响。选取雄性ICR(TLR4+/+)、C3H/HeN(TLR4+/+)和C3H/HeJ(TLR4-/-)小鼠各20只，随机分为5组：对照组、酒精处理0.5h组、酒精处理2h组、酒精处理6h组和酒精处理12h组。实验中所有小鼠均禁食，酒精处理（0.5h、2h、6h和12h）各时点组小鼠分别在禁食（13.5h、12h、8h和2h）后灌胃给予酒精（4g/kg），对照组灌胃给予等容量生理盐水。所有小鼠禁食14h后剖杀，取部分肝脏组织匀浆用ELISA检测肝脏中TNF-α水平，另一部分肝脏组织用Westernblot技术检测单剂量酒精暴露对小鼠肝脏MyD88、NF-κBp65蛋白表达和IκBα磷酸化水平的动态影响。实验四、为进一步探讨TLR4产生的活性氧在单剂量酒精暴露诱发肝脏SREBP-1c激活和脂质沉积中的作用。将雄性TLR4+/+和TLR4-/-小鼠各12只分别随机分成酒精处理组和对照组，所有小鼠禁食12h后，酒精处理组小鼠单次灌胃给予4g/kg酒精，对照组小鼠灌胃给予等容量生理盐水。灌胃2h后剖杀所有小鼠，取肝脏组织-80°C保存用qPCR技术检测肝脏NADPH氧化酶亚基p67phox,gp91phox,p22phox和p47phoxmRNA水平。为了深入研究PBN对酒精引起的肝脏脂肪沉积的影响，取16只雄性ICR小鼠随机分为4组，即酒精处理组、PBN干预组、单纯PBN组和对照组。酒精处理组小鼠单次灌胃给予4g/kg酒精，对照组小鼠灌胃给予等容量生理盐水，PBN干预组小鼠于给予酒精前30min和给予酒精后4h分别腹腔注射PBN（100mg/kg），单纯PBN组于与PBN干预组小鼠对应时点腹腔注射PBN（100mg/kg）。给予酒精12h后剖杀所有小鼠，取肝脏组织制备冰冻切片用于油红O染色；其它肝脏组织-80°C保存检测肝脏TG含量，用Westernblot检测肝脏SREBP-1c核蛋白水平。结果酒精处理组ICR(TLR4+/+)和C3H/HeN(TLR4+/+)小鼠肝脏TLR4信号均被激活，但对C3H/HeJ(TLR4-/-)小鼠无明显影响。与此相一致的是酒精处理使ICR(TLR4+/+)和C3H/HeN(TLR4+/+)小鼠肝脏发生了明显的脂质沉积，而对C3H/HeJ(TLR4-/-)小鼠无明显影响。进一步研究结果显示酒精处理显著激活ICR(TLR4+/+)和C3H/HeN(TLR4+/+)小鼠肝脏SREBP-1，但对C3H/HeJ(TLR4-/-)小鼠无明显影响。进一步深入的研究结果显示单剂量酒精处理明显激活C3H/HeN(TLR4+/+)小鼠肝脏PI3K/Akt，而对C3H/HeJ(TLR4-/-)小鼠中无明显影响。另外，单剂量酒精处理对C3H/HeN(TLR4+/+)小鼠血清胰岛素水平和肝脏血清胰岛素底物irs-1和irs-2mRNA水平也无明显影响。单剂量的酒精未升高肝脏炎性细胞因子的表达。此外，酒精处理使C3H/HeN(TLR4+/+)小鼠肝脏中两个NADPH氧化酶p67phox和gp91phoxmRNA水平显著升高，而对C3H/HeJ(TLR4-/-)小鼠无明显影响。自由基清除剂PBN能保护急性酒精引起的肝脏SREBP-1的激活和脂质沉积。结论TLR4产生的活性氧，而不是炎性细胞因子，介导急性酒精引起的肝脏SREBP-1激活和脂质沉积。