目的脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是神经元细胞的轴突临时或永久性的损伤,如脊髓的正常运动、感觉、或自主神经功能的损伤,从而导致严重的神经系统功能紊乱。目前,大多数正在研究的治疗脊髓损伤的方法都旨在减少脊髓损伤相关的症状以及促进功能性神经纤维的再生。Ras/Raf/ERK1/2信号通路是与细胞生存、生长、增殖和死亡相关的主要细胞内信号通路,越来越多的证据表明这条信号通路在中枢和外周神经系统中发挥着重要的作用,例如树突和轴突的形成以及神经元极性的形成等。因此,本研究通过建立脊髓损伤细胞模型以及小鼠脊髓损伤模型从体外实验和体内实验两部分来验证Ras/Raf/ERK1/2信号通路抑制剂U0126在脊髓损伤后的修复作用及其可能的作用机制。方法体外实验采用NYU IMPACTOR MODEL-Ⅱ脊髓打击器制作C57BL/6J小鼠脊髓损伤动物模型,在此基础上建立脊髓损伤细胞模型(SCI组),术后1周选取脊髓损伤部位进行分离培养脊髓损伤后运动神经元细胞,对照组采用出生1天的幼鼠培养脊髓运动神经元细胞。通过电镜及免疫荧光方法鉴定脊髓运动神经元细胞,并鉴别损伤前后细胞的差异。通过Western-blot、细胞迁移和粘附、轴突染色(Di L)等技术观察U0126对神经元细胞功能和神经元轴突树突再生的影响。体内实验同样采用NYU IMPACTOR MODEL-Ⅱ脊髓打击器制作C57BL/6J小鼠脊髓损伤动物模型,随机分为三组:A组:假手术组(单纯椎板切除,不进行脊髓损伤打击,注射DMSO)、B组:对照组(脊髓损伤组,注射DMSO)以及C组:实验组(脊髓损伤治疗组,注射U0126),采用BMS评分对脊髓损伤后小鼠运动功能恢复状态进行评价,并通过免疫组织化学染色观察损伤周围神经元细胞特异性的标记物NF200以及星形胶质细胞特异性标记物GFAP的表达情况。结果1.电镜下均观察到神经元细胞,Neu N染色阳性,通过免疫荧光染色显示在SCI组中抗突触素抗体(Synaptophsin)、抗VGLUT1抗体和抗VGAT抗体荧光染色均较对照组明显减弱(P<0.05),差异具有统计学意义。蛋白免疫印迹法的实验结果显示U0126在SCI组中抑制ERK蛋白的磷酸化作用较在Sham组中的抑制作用更加彻底。细胞迁移实验结果表明在脊髓损伤后SCI组细胞的迁移能力较Sham组明显增强(P<0.05),而细胞的粘附能力减弱(P<0.05),差异具有统计学意义。采用U0126抑制剂后发现SCI组细胞的迁移和粘附能力均较对照组增加(P<0.05),差异具有统计学意义轴突染色的结果显示在脊髓损伤后SCI组树突棘的密度较对照组明显下降(P<0.05),而使用U0126抑制Ras/Raf/ERK1/2信号通路后,成熟树突棘的形成显著增加(P<0.05),差异具有统计学意义。2.BMS评分结果显示在脊髓损伤后7天,使用抑制剂U0216组的小鼠BMS评分较对照组显著高(P<0.05),差异具有统计学意义。免疫组化染色结果显示,在脊髓损伤中心周围可以见到NF-200阳性染色的细胞,而且在给予U0126腹腔注射的C组其脊髓损伤中心周围NF-200阳性细胞染色IOD值较对照组显著增多,差异具有统计学意义(P=0.041),在脊髓损伤中心周围也可见大量GFAP阳性染色的星形胶质细胞,给予U0126抑制后,实验组和对照组差异有统计学意义(P=0.030)。结论通过体外和体内实验表明Ras/Raf/ERK1/2通路抑制剂U0216对脊髓损伤具有一定的修复作用,其对脊髓损伤的修复作用可能与促进细胞的迁移和粘附能力以及增加神经元树突棘密度并促进其成熟有关,而且Ras/Raf/ERK1/2信号通路的激活参与了脊髓损伤的过程以及损伤后疤痕的形成过程,给予U0126抑制后,能够减少脊髓损伤周围神经元细胞的凋亡以及减少胶质疤痕的形成。因此,Ras/Raf/ERK1/2信号通路可能是脊髓损伤修复新的靶点。