论文部分内容阅读
人参(Panax ginseng C.A.Mey.)为五加科多年生草本植物,是我国传统名贵中药材。其连作障碍问题十分突出,使人参不论从表观品质还是内在品质上都显著下降,严重时甚至造成绝收。化感自毒物质会导致土壤微生物种群结构、理化性状变化,被认为是引起连作障碍的主要原因之一。目前针对在自毒物质胁迫下人参基因差异表达的研究较少。本课题在前期转录组测序分析化感自毒物质苯甲酸胁迫下人参基因差异表达的基础上,根据测序结果结合功能注释信息分析了人参生理指标相关基因和转录因子基因的表达情况,从中挑选出1个WRKY转录因子基因克隆全长,对该基因进行深入的生物信息学分析并将其转入到模式植物拟南芥中,为进一步研究人参响应化感自毒物质胁迫的分子机制奠定了基础。主要成果如下:(1)用实时荧光定量PCR的方法研究了苯甲酸胁迫下人参生理指标相关基因的差异表达情况,共7个基因。经分析发现,其中1个脯氨酸相关基因P5CS、1个丙二醛相关基因APX、2个活性氧(ROS)相关基因及2个过氧化物酶(POD)基因在苯甲酸胁迫后显著上调表达。(2)研究了苯甲酸胁迫下人参转录因子基因的差异表达情况,共13个基因。经分析发现,其中8个WRKY基因、3个MYB基因及1个AP2/ERF基因在苯甲酸胁迫后显著上调表达;1个MYB基因下调表达。(3)根据苯甲酸胁迫下的人参转录组数据,设计全长扩增引物,利用RT-PCR法获得1条编码WRKY转录因子的基因,命名为WRKY7(GenBank登录号:KX255632),并对其进行TA克隆、测序和生物信息学分析。发现该基因cDNA全长1216 bp,其开放阅读框(ORF)为1014 bp,编码337个氨基酸,有1个WRKY结构域,其锌指结构为C2HC型,属于WRKY转录因子家族第Ⅲ类成员。经核苷酸水平同源性分析表明,该基因与西洋参的WRKY6(JF927162.1)、WRKY9(JF927165.1)亲缘关系最近,同源性均为87%。(4)构建了 pCAMBIA2300-WRKY7过表达载体,将其转入到农杆菌GV3101中,通过菌落PCR鉴定阳性克隆。采用浸花法将目的基因转入到哥伦比亚型拟南芥中,通过MS-Kan+培养基筛选获得转基因株系,经过三代筛选获得转基因纯系,为后续进行功能研究奠定了基础。