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目的:通过高通量测序技术筛选得到大鼠脑出血后脑组织的环状RNA(circular RNA,circ RNA)表达谱,然后对差异性表达的circ RNA进行验证和生物信息学分析,从转录组学的角度研究脑出血的分子生物学机制,探索脑出血病理过程中的关键调控靶点,为脑出血的治疗提供新策略。方法:(1)脑出血(intracerebral hemorrhage,ICH)模型的建立:参照Rosenberg等的方法建立脑出血模型,参照包新民《大鼠脑立体定位图谱》进行尾壳核定位,取前囟前1.0mm、矢状缝右侧3.1mm、深6mm为注射点,VII型胶原酶0.2U/ul共2ul于定位点注射。(2)实验分组:18只SD雄性大鼠随机分为24小时假手术组、24小时模型组及48小时模型组,每组6只。(3)取材:根据时间点新鲜取材,得到脑出血灶周脑组织标本,液氮保存。(4)Circ RNA测序:使用高通量测序技术,先提取脑组织总RNA,样品质控合格后去除核糖体RNA(r RNA)线性RNA,构建circ RNA测序文库,在Hiseq Xten测序仪上测序,对原始数据进行分析和处理,用circbase和exorbase对circ RNA进行注释,筛选出表达差异显著的circ RNA。(5)Circ RNA-Seq数据准确性验证:在差异性表达显著的circ RNA中随机挑选4个cir RNA使用实时定量PCR(RT-PCR)方法进行验证,验证其与高通量测序结果是否具有一致性。(6)差异性表达circ RNA生物信息学分析:对差异表达的circ RNAs进行基因本体论(GO分析)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路分析;(7)差异表达circ RNAs与微小RNA(mi RNA)相互作用预测:利用Target Scan、mi Randa和RNAhybrid软件进行circ RNA-micro RNA相互作用预测,并使用Cytoscape软件构建了其中40个差异表达的circ RNAs(10个下调和30个上调)与其可能结合的排名前5位的micro RNAs相互作用网络图。结果:(1)本研究成功构建胶原酶注入脑出血大鼠模型,神经功能评分有效,大体标本可见模型组脑出血位于尾壳核内,血肿明显。(2)样品质检结果显示样品质量良好,测序组织样本具有高度相关性,假手术组与模型组脑组织样本circ RNA的对比结果显示,假手术组大鼠脑组织在可检测水平表达了13330个circ RNAs,其主要来自外显子区域(13165个)。与假手术组相比,脑出血24小时后有346个circ RNAs可见差异表达,其中表达上调有198个、下调有148个;脑出血48小时后有389个circ RNAs差异表达,其中表达上调有248个、下调有141个;表达差异的circ RNAs中,共有86个circ RNAs在脑出血后24小时、48小时均有差异性表达。脑出血组出血灶周脑组织circ RNAs的表达有明显差异。差异表达的circ RNAs广泛分布于所有染色体,且大部分差异表达circ RNAs来源于外显子(exonic),很少一部分来源于接合区域(splicing)。(3)GO分析脑出血后差异表达circ RNAs的亲本基因控制的生物学和分子功能主要是生物过程的调节、转运、细胞组分的组成、细胞定位的确立,整合、催化活性、核苷酸结合、蛋白质及小分子物质的结合等。(4)KEGG通路分析发现脑出血后24小时差异表达的circ RNAs主要富集的通路为多巴胺能突触、逆行内源性大麻素信号传导、谷氨酸能突触、泛素介导的蛋白水解作用信号通路、MAPK信号通路、胞吞作用、GABA能突触等;然而脑出血48小时后,KEGG分析显示差异表达的circ RNAs富集最多的通路是逆行内源性大麻素信号传导通路,提示可能随着脑损伤后时间的推移,逆行内源性大麻素信号传导通路在脑损伤后发挥重要的调节功能。(5)RT-PCR法结果显示,筛选的4个差异表达circ RNAs中,Circ Fhod3验证结果与高通量测序结果有较好的一致性。(6)circ RNA-micro RNA网络图所示,得到验证的circ RNA(rno_circ:chr18:17224244-17264715)即Circ Fhod3与mi R-211结合,而研究证明mi R-211与细胞凋亡的调节有关,其作为“pro-survival micro RNA”,减弱促凋亡转录因子chop/gadd153的应激依赖性表达,Mi R-211直接靶向近端chop/gadd153启动子,增加组蛋白甲基化并抑制chop表达,起到抑制细胞凋亡的作用。(7)mi RNA-m RNA网络互作图所示,mi RNA-211可与众多的m RNA结合,可能参与炎症、氧化应激及自噬等调节过程,影响脑出血后病理生理过程。结论(1)大鼠脑出血后脑组织的circ RNAs表达呈显著性差异,提示差异表达的circ RNAs参与了脑出血后特定的病理过程,并影响神经功能。(2)生物信息学预测提示,脑出血后差异表达的circ RNAs与mi RNAs、mi RNAs与m RNA之间的相互作用可能是脑出血后脑损伤的病理生理机制之一。(3)环状Circ Fhod3在脑出血后表达显著下调,提示其可能是脑出血后病理过程中的关键分子靶点。