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脓毒症是由感染因素介导的全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS)。构成革兰阴性菌外膜的主要成分内毒素(lipopolysaccharide,LPS)是介导脓毒症的主要病原分子,在脓毒症的病理生理过程中发挥着重要的作用。LPS进入机体后,与单核-吞噬细胞系统细胞膜上的模式识别受体TLR4结合,将信号转入胞内,介导炎症细胞活化,释放炎症介质(如TNF-α、IL-1和IL-6等)而引发机体的炎症反应,此过程LPS不进入胞内即可启动信号转导。除此之外,LPS还可通过TLR4介导的网格蛋白依赖方式进行内化(Internalization)而进入胞内,以往一直认为这种方式与LPS的降解与代谢相关,但最近有研究表明,LPS内化与细胞活化有着密切关联,本课题组前期研究也表明,内体酸化抑制剂氯喹(Chloroquine,CQ)对LPS攻击小鼠具有明显的保护作用,其作用机制不明确。因此,探讨LPS内化过程与炎性细胞活化的关系,对进一步深入了解LPS介导脓毒症发生的病理生理机制具有重要意义。目的用内体成熟抑制剂CQ抑制RAW264.7细胞内体成熟,观察内体成熟障碍对LPS在内体的分布情况以及对LPS刺激的RAW264.7细胞活化的影响。方法(1)使用异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocynate, FITC)标记LPS,激光共聚焦显微镜下观测其示踪效果。(2)以FITC-Dextran为内体pH荧光探针,在激光共聚焦显微镜下通过荧光强度变化测定内体pH,并进一步使用不同浓度的内体成熟抑制剂CQ处理细胞,换算出CQ浓度与内体pH值的对应关系。设置系列CQ浓度和尼日利亚菌素-pH梯度溶液处理LPS刺激的RAW264.7细胞,以观察内体pH变化对RAW264.7细胞中LPS的分布和细胞活化的影响。(3)使用激光共聚焦显微镜观察FITC-LPS在胞膜及胞内的分布情况。(4)用CQ预处理RAW264.7细胞后加入刺激因素LPS,分别在4h和16h收集细胞上清液,采用ELISA方法检测细胞因子TNF-a和IL-6,观察LPS刺激的RAW264.7细胞在内体成熟障碍下细胞的活化情况。结果(1)使用FITC标记LPS,经超滤方法纯化后,标记效率为33.13 mol FITC / mol LPS,激光扫描共聚焦显微镜下观察示踪效果好于商业化试剂,可以用于本课题LPS示踪。(2)使用激光共聚焦显微镜检测FITC-Dxtran荧光值,根据CQ浓度与pH的对应关系,观察到随着CQ浓度增加内体pH升高,并呈现明显的线性关系,其中,CQ在浓度为20ug/ml时将内体pH作用到pH5.07。(3) CQ的细胞毒性浓度为30ug/ml,此范围内,梯度浓度的CQ预处理RAW264.7细胞细胞之后,LPS在胞内的聚集随着CQ的浓度增加而增加,该结果与利用尼日利亚菌素-梯度pH缓冲液调节内体pH后,LPS在胞内的聚集情况结果一致。(4)经CQ预处理的RAW264.7细胞,在LPS刺激作用下, TNF-α和IL-6的释放与CQ浓度成负相关,表明内体成熟障碍对LPS刺激的细胞活化具有抑制作用。结论(1)用FITC成功标记LPS,解决了LPS示踪无商品试剂供给的问题。(2) RAW264.7细胞内体酸化成熟障碍,可导致LPS在细胞内的聚集。(3) RAW264.7细胞内体成熟障碍对LPS刺激的细胞活化具有抑制作用。