论文部分内容阅读
研究背景：肿瘤基因疫苗(即DNA疫苗)是近年来国内外研究的热点,它主要通过激活患者自身免疫系统,以达到清除或控制肿瘤的目的。研究目的：本实验将HBV X基因,MAGE-1基因与载体pVAX-1相连,构建针对肝癌的治疗性重组基因疫苗pVAX-aHCC并通过高效液相的方法将其纯化。旨在建立重组DNA疫苗的实验室制备工艺,并对该纯化重组DNA疫苗进行初步的质量控制及检定,为基因疫苗的药理学研究及规模化生产奠定基础。研究方法：(1)利用真核表达载体质粒pVAX-1,将HBV X基因,MAGE-1基因与其相连,构建针对肝癌的治疗性重组基因疫苗pVAX-aHCC。(2)将已构建好的治疗性肝癌重组DNA疫苗(pVAX-aHCC)转化大肠杆菌JM109。制备LB种子液,摇瓶培养,收集菌体,以碱裂解、回收等方法处理后得到质粒DNA的粗制品。(3)利用色谱原理,通过Sepharose 6FF, Plasmid Select, DEAE Sepharose FF层析系统对其进行纯化,并按照FDA推荐的临床用DNA的质量监控标准,对纯化重组DNA疫苗进行质量控制及检定。研究结果：(1)本试验成功构建了真核重组质粒pVAX-aHCC。(2)每1L发酵菌可获得12mg质粒,纯度OD260/280为1.79,超螺旋质粒比例为91.7%。经检测,纯化的质粒DNA疫苗中无RNA、菌体蛋白质、菌体基因组DNA、细菌内毒素等残留量；热稳定性良好,可以耐受一定范围的高温；并从转化效率、酶切效果等方面进行质量鉴定,结果显示,该制品符合FDA推荐的临床用质粒DNA的质量标准。研究结论：本实验,成功地利用真核表达载体质粒pVAX-1,构建了新型肝癌治疗性重组DNA疫苗(pVAX-aHCC),并对重组的基因疫苗进行了纯化,经Sepharose 6FF, Plasmid Select, DEAE Sepharose FF层析系统纯化的质粒DNA纯度高,符合FDA推荐的临床用质粒DNA的质量标准。