肥胖、糖尿病、心血管疾病等代谢综合征相关疾病发病率日益升高,且已成为一个全球性的健康问题,而胰岛素抵抗是导致代谢综合征的共同病理生理基础,众多肥胖、糖尿病及冠心病的患者均存在不同程度的胰岛素抵抗。目前针对改善胰岛素抵抗所开展的药物研发一直是防治代谢综合征的重要方向,而胰岛素分子信号通路IRS-PI3K-AKT 一直是胰岛素抵抗研究的重要靶点。正常情况下,循环中的胰岛素能够与外周胰岛素敏感组织如肝脏、肌肉和脂肪细胞上的胰岛素受体相结合,通过胰岛素信号通路IRS-PI3K-AKT促进靶细胞对葡萄糖的摄取、有氧氧化,促进糖原的合成、抑制糖异生和糖原分解、促进脂肪的合成与贮存以维持血糖的平衡。研究表明肥胖、糖尿病是一种慢性炎症状态,体内多种炎症细胞因子通过损害胰岛素信号通路的转导而参与胰岛素抵抗的发生、发展,其中以TNF-α诱导的胰岛素抵抗正成为研究热点。维生素C是一种小分子化合物,作为水溶性抗氧化剂及体内多种酶的辅因子参与机体多种生物学功能。相关研究表明维生素C能够对糖尿病及其并发症发挥保护作用,但维生素C对胰岛素抵抗的作用仍不明确。因此,本研究首先以古洛糖酸内酯氧化酶(L-gulono-1,4-lactone oxidase,Gulo)基因敲除的小鼠为研究对象,通过其自身不能合成维生素C,来探讨维生素C缺乏与胰岛素抵抗的相关性,进一步以人来源的肝癌细胞系HepG2为研究对象,探讨维生素C改善胰岛素抵抗的可能分子机制,为维生素C在代谢综合征的防治应用中提供理论基础。第一部分维生素C缺乏与胰岛素抵抗相关性的探讨目的:通过建立TNF-α诱导的胰岛素抵抗的Gulo-/-小鼠动物模型,分析补充维生素C至正常水平对胰岛素抵抗相关指标的影响,探讨维生素C缺乏与胰岛素抵抗的相关性。方法:Gulo-/-小鼠背部皮下埋植TNF-α(8μg/kg·day)渗透压泵7天,建立TNF-α诱导的胰岛素抵抗动物模型,同时饮水中补充维生素C(0.33 g/L和3.3 g/L)分别建立维生素C缺乏组和维生素C正常组。通过腹腔葡萄糖耐量试验测定不同时间点血糖,ELISA法测定空腹胰岛素水平,酶标仪比色法测定肝脏组织中甘油三脂、总胆固醇含量和糖原水平,苏木素-伊红(HE)染色分析肝脏病理结构,免疫组织化学法检测肝脏中NF-κBp65蛋白表达,Western blot分析肝脏组织中胰岛素信号分子AKT和GSK3β的表达及磷酸化水平,Real-time PCR测定肝脏组织中IL-1α IL-6、PEPCK、G6P、ACC1 和 FAS 的 mRNA 水平。结果:1)在维生素C缺乏的状态下,TNF-α能够诱导Gulo-/-小鼠发生胰岛素抵抗,表现为葡萄糖耐量减低,空腹胰岛素水平升高,肝脏中脂质堆积、糖异生及脂肪合成相关基因mRNA水平升高、糖原含量降低及胰岛素信号分子AKT和GSK3β的磷酸化减少;此外,TNF-α能够促进Gulo-/-小鼠肝脏中NF-κBp65蛋白的活化,IL-1α和IL-6的mRNA水平升高。2)在TNF-α诱导Gulo-/-小鼠发生胰岛素抵抗的前提下,维生素C正常组小鼠较维生素C缺乏组小鼠葡萄糖耐量改善,空腹胰岛素水平下降,肝脏组织中脂质堆积减少、糖异生和脂肪合成相关基因mRNA水平降低、糖原含量升高及胰岛素信号分子AKT和GSK3β的磷酸化增加,并且维生素C正常组小鼠较维生素C缺乏组小鼠肝脏中NF-κBp65蛋白活化减少、IL-1α和IL-6的mRNA水平降低。结论:维生素C缺乏促进TNF-α诱导的Gulo-/-小鼠发生胰岛素抵抗,补充维生素C至正常水平能够改善TNF-α诱导的胰岛素抵抗,抑制Gulo-/-小鼠肝脏NF-κBp65蛋白活化、降低IL-1α和IL-6的mRNA水平,提示维生素C能够改善胰岛素抵抗,可能涉及抑制炎症反应。第二部分维生素C改善胰岛素抵抗的可能机制目的:通过建立TNF-α诱导的胰岛素抵抗的HepG2细胞模型,验证维生素C改善胰岛素抵抗的效应,并探讨其可能机制。方法:TNF-α(10ng/ml)刺激人肝癌细胞系HepG2细胞24h,建立胰岛素抵抗的细胞模型,在此基础上加用不同浓度维生素C(0～200 μmol/L)预处理细胞不同时间(4h～48h),CCK-8法检测细胞存活率,酶标仪比色法检测细胞内糖原水平,流式细胞术检测细胞对葡萄糖的摄取率,免疫荧光法检测P-NF-κBp65的胞核转移水平,Real-time PCR测定糖异生相关基因PEPCK、G6P和脂肪合成相关基因ACC1、FAS的mRNA水平,Western blot分析胰岛素信号通路分子IRS-1、AKT、GSK-3β和GLUT2的蛋白表达及磷酸化水平及炎症信号通路分子JNK、p38、ERK、IKKβ、IκBα和NF-κBp65的蛋白表达及磷酸化水平。结果:1)维生素C在浓度为100μmol/L及以下时,对细胞的生长没有影响。2)维生素C浓度和时间依赖的改善TNF-α对HepG2细胞糖原合成的损害作用。3)维生素C改善TNF-α对HepG2细胞葡萄糖摄取的损害作用。4)维生素C改善TNF-α损害的胰岛素信号通路:P-IRS-1丝氨酸(Ser312)磷酸化降低,酪氨酸(Tyr632)磷酸化增加,AKT和GSK的磷酸化水平升高,GLUT2总蛋白表达升高。5)维生素C抑制TNF-α诱导的胰岛素抵抗状态下HepG2细胞内PEPCK、G6P、ACC1和FAS的基因转录水平。6)维生素C抑制TNF-α对JNK、p38和IKKβ/IκBα/NF-κB信号通路的活化,但对TNF-α活化的ERK抑制不明显。结论:维生素C通过调节IRS-1/AKT/GSK3β信号通路、上调GLUT2蛋白表达改善TNF-α诱导的HepG2细胞的胰岛素抵抗,其机制可能涉及抑制TNF-α对JNK、p38和IKKβ/IκBα/NF-κB信号通路的活化。