东方粘虫Mythimna separatea(Walker)属鳞翅目,夜蛾科,是禾本科作物的主要害虫。东方粘虫中肠上皮细胞刷状缘膜囊泡(Brush Border Membrane Vesicles,BBMV)中有一种Ⅴ型H+ATP酶,将ATP水解时产生的能量形成质子梯度来调节细胞内的pH环境。近些年越来越多学者已经将V-ATP酶作为药物靶标来研究。本研究针对东方粘虫中肠BBMV中V-ATP酶A和B亚基进行研究,对东方粘虫中肠BBMV中V-ATP酶A亚基基因(vatpa)和B亚基基因(vatpb)进行了克隆、原核表达及复性纯化。主要结果如下:利用Trizol法提取东方粘虫中的总RNA,通过反转录和聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)扩增,得到cDNA,然后以这条序列为基础,设计3’端和5’端特异性引物,再利用快速扩增技术(Rapid Amplification of cDNA Ends,RACE)克隆得到东方粘虫中肠BBMV的3’端和5’端序列,最后通过拼接得到vatpa的cDNA全长序列,该核苷酸序列共2180 bp,包含一个长1854 bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),该开放阅读框的起始密码子为ATG,终止密码子为TAG,翻译得到由617个氨基酸组成的蛋白质,预测该蛋白分子量为68.21 ku,预测等电点(pI)为5.22。通过序列同源性和系统进化树分析得到东方粘虫中肠vatpa氨基酸序列与鳞翅目天蛾科烟草天蛾(M.sexta)的同源性最高,为96%。设计特异性引物,以东方粘虫cDNA为模板克隆得到其vatpa和vatpb,选取pET22b作为原核表达载体(该载体N端带有His-tag标签),用In-Fusion法将目的基因与载体进行连接,成功构建了原核表达载体pET22b-vatpa和pET22b-vatpb。在20℃下,用不同浓度0.1 mmol/L、0.5 mmol/L、1 mmol/L的IPTG对其进行诱导,电泳结果显示,vatpa和vatpb表达的蛋白分子量分别约为74 ku和60 ku,成功表达了 A、B亚基。分离洗涤包涵体,经透析复性成功后,将复性后上清液通过Ni-NTA柱进行亲和层析纯化,经SDS-PAGE电泳检测获得了较纯的vatpa和vatpb蛋白分子。综上所述,本研究成功克隆了 V-ATP酶A亚基cDNA全长基因,构建了原核表达质粒pET22b-vatpa和pET22b-vatpb,并实现了其在宿主菌中的高效表达,获得了较纯的蛋白,这一研究结果为进一步研究各蛋白的晶体结构,药物小分子与A、B亚基大分子的相互作用,特别是以A、B亚基为筛选模型创制新农药奠定了基础。