研究背景及目的随着抗病毒药物的广泛使用,能够对患者起到疗效监控作用的乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)定量检测技术成为市场上研究开发热点。光激化学发光免疫分析(Amplified Luminescent Proximity Homogeneous Assay, AlphaLISA)是一种基于微球载体的均相检测技术,可以非常快速的进行定量检测,非常适合用于HBsAg的定量检测。与传统微孔板为固相载体的免疫检测相比,该技术具有灵敏度高(pg级),背景低(空白计数<100),反应时间大大缩短(整个分析过程不超过35分钟),性质稳定,操作简便,易于微型化自动化,应用范围广,价格低廉等优点。本论文中对该技术的研究开发获得了国家“艾滋病和病毒性肝炎等重大传染病防治”科技重大专项的支持。时间分辨荧光免疫分析(Timed-resolved fluoroimmunoassay, TRFIA)是一种灵敏的高端定量免疫检测技术,是以镧系稀土离子作为标记物来标记抗原或抗体,因镧系稀土离子具有独特的荧光特性,该技术能够获得极高的信噪比,从而具有很高的灵敏度,且还具有标记物制备简便、储存时间长、无放射性污染、检测重复性好、操作流程短、标准曲线范围宽、不受样品自然荧光干扰和应用范围十分广泛等优点。时间分辨荧光免疫分析相对于酶免分析、放射免疫分析有更高的临床应用价值。该技术适用于各种抗原抗体的临床检测,在市场上已得到广泛应用。有必要再开发出高灵敏度的HIV的时间分辨荧光免疫分析检测技术,应用于临床检测,完善产品群。方法：(一)采用双抗体夹心法研制乙型肝炎病毒光激化学发光免疫分析试剂1.采用HBsAg抗原配制定标品及质控品,定标品浓度：0IU/mL、0.04IU/mL、0.8IU/mL、4IU/mL、20IU/mL、100IU/mL。2.生物素与抗体连接：在带有滤膜的离心管中加入抗体1mg,8000rpm离心5-6min。用连接缓冲液(pH9.5Na2CO3/NaHCO3)重复洗涤6次后,在200μL抗体溶液中加入2μL40mg/mL活化生物素(用DMSO配制),室温振动孵育4h。透析去除多余的活化生物素。3.发光微球与抗体连接：在带有滤膜的离心管中加入0.2mg另一株抗体,8000rpm离心5-6min,每次用PBS缓冲液洗涤,重复6次,收集纯化后的抗体,在抗体溶液中加入1mg发光微球、10μL25mg/mLNaBH3CN(用上述PBS缓冲液配制)、1.25μL10%Tween-20,37℃振荡孵育48h。加入10μL65mg/mLCMO(用0.8M NaOH配制)封闭未结合位点,37℃振荡孵育1h后离心洗涤,得到已连接抗体的发光微球。4.采用棋盘滴定法对偶联抗体的发光微球及生物素化抗体的最佳稀释度进行确定。5.对加样体积(10μL、20gL、50μL),反应温度(25℃、30℃、37℃)以及两个反应阶段的时间(5min、15min、30min)进行优化。6.以adr亚型、ay亚型抗原筛选对其识别能力高的抗体。7.参考值的确定：以自制的乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)定量测定试剂盒(均相发光法)检测504份相对健康人血清,统计检测得到的HBsAg浓度值的分布情况。根据分布的百分比,初步确定为HBsAg正常人参考值,再综合其他文献研究资料及临床现行参考值范围,最终确定正常人参考值。8.试剂性能指标的评价8.1最低检出量：重复测定零定标品(A)10次,求出测得信号值的均值和标准差,以均值加上二倍标准差的信号值代入剂量-反应曲线求出浓度值,为该试剂盒的最低检出量。用国家参考品的最低检出量参考品测定,包括adr亚型、adw亚型、ay亚型。8.2准确性：测定系列稀释的WHO国际参考品。8.3线性：在定标品B(0.04IU/mL)与定标品F(100IU/mL)之间的浓度范围内,用双对数拟合,计算剂量-反应曲线相关系数(r)。8.4HOOK效应：以HBsAg原料加入正常人血清中,配制成系列浓度,进行检测。用双对数拟合,绘制剂量反应曲线。8.5精密性：重复测定Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三个血清质控品各10次,得到质控品检测值的均数、标准差及CV值。8.6特异性：将一定浓度的干扰物质作为样本进行检测。8.7阴、阳性参考品符合率：对国家参考品进行测定,检测符合率。8.8抗干扰实验：对加入了血红蛋白、甘油三酯和胆红素的阳性标本进行测定,计算其回收率。8.9稳定性：试剂盒储存于37℃7天后,评价其最低检出量、准确性、线性、精密性指标。8.10临床考核试验：临床研究设计采用盲法、对照的试验设计,在三家医院进行。采用已上市同类试剂博阳生物公司的乙型肝炎病毒表面抗原定量检测试剂盒(化学发光法)作为对照试剂。对临床研究数据进行统计分析,计算灵敏度、特异度、总符合率、调整一致性、相关系数等指标。(二)合成感光化合物,制备链霉亲和素化感光微球。1.以5-叔丁基-1,3-二亚氨基异吲哚啉作为起始原料,合成感光化合物四叔丁基二(三已基硅基)硅酞菁,测定终产物的质谱和紫外光谱。2.感光化合物在105℃油浴加热条件下融入乙醇-胺基乙醇溶胀的聚苯乙烯微球。3.以EDC和NHS将链霉亲和素共价偶联至带有羧基的感光微球上4.评价自制感光微球,测定其直径,应用于光激化学发光检测,与Perkinelmer公司产品做比较。(三)用双抗原夹心法研制人免疫缺陷病毒抗体时间分辨荧光免疫分析试剂。1.以正常人血清作为阴性对照,以正常人血清稀释Goat anti HIV-1,作为阳性对照。2.用包被液将包被抗原H67稀释后包被,4℃过夜,封闭,真空抽干,—20℃冷冻保存。比较包被抗原用β-巯基乙醇处理与不处理的差异。3.Eu3+标记抗原的制备：以超滤管纯化抗原后,按质量比2：1与铕标记试剂充分混匀,置于4℃过夜,次日过凝胶层析柱纯化,根据280nm蛋白的吸光度的高低选择吸光度高的几管合并。用标记抗原稀释缓冲液对其进行适当稀释,并加入铕标保护液,过滤后冻干,置一20℃保存。4.采用棋盘滴定法对最佳包被量及标记抗原最佳稀释度进行确定。选择阳性荧光值较高、阴性本底较低,信噪比高的为最佳包被量及稀释度。5.参考值范围：以自制的HIV抗体-TRFIA试剂检测409份健康人血清,统计血清HIV抗体水平的分布情况,计算样本荧光值与阴性对照的比值。取比值的平均值,以比值均值加两个标准差,初步确定为试剂盒的正常人参考值,再综合其他文献研究资料及临床现行参考值范围,最终确定参考值范围。6.性能评价6.1检测中国药品生物制品检定所国家参考品,测定阴阳性参考品的符合率,最低检出限,精密性。6.2抗干扰性分析：对加入了血红蛋白、甘油三酯和胆红素的阴、阳性标本进行测定,判断干扰情况。6.3特异性分析：临床上可能与HIV检测有交叉反应的血清样本各10例,以自制试剂盒和对照试剂进行对比检测,评价试剂盒检测的交叉反应性。6.4血清血浆检测的对比：HIV标本分别处理成血清、柠檬酸钠抗凝血浆、EDTA抗凝血浆样本,确定血清、血浆检测结果是否一致。6.5稳定性：37℃放置7天,检测试剂盒各项性能指标。6.6临床考核试验：临床研究设计采用盲法、对照的试验设计,在三家医院进行。采用生物梅里埃公司生产的HIV抗体酶联免疫检测试剂盒作为对照试剂。对临床研究数据进行统计分析,计算灵敏度、特异度、总符合率、调整一致性等指标。结果：(一)采用双抗体夹心法研制乙型肝炎病毒光激化学发光免疫分析试剂1.综合考虑本底信号值、信噪比因素,选择1：100作为偶联抗体的发光微球的最佳稀释度,1：200作为生物素化抗体的最佳稀释度。2.20μL加样体积具有足够高的发光值,又不致受到干扰,故选择20gL加样体积。37℃的发光值最高,且本底仍然保持较低水平,因此选定37℃为反应的温度。孵育15min已经达到免疫反应平衡,故选定此孵育时间。3.B028对adr亚型识别力较高,而S015对ay亚型识别力较高,二者共同生物素化,混合使用,可以起到互补的效果,对adr亚型和ay亚型均能很好的识别。4.504份相对健康人血清,当浓度值在≤0.04IU/mL时,包含了99.40%的样本。据此设定本试剂盒检测时的人血清HBsAg浓度的cut-off值为0.04IU/mL。5.性能评价的结果显示：5.1计算得出试剂盒的最低检出量为0.01IU/mL。以国家参考品的最低检出量参考品测定,参考品adr0.1IU/mL,参考品adw0.1IU/mL,参考品ay0.2IU/mL均测为阳性,符合国家参考品要求。5.2国际标准品的实测浓度与期望浓度测值的比值在0.97-1.03之间,符合标准品准确性评价要求。高值达3874IU/mL的血样以分析缓冲液系列稀释测定,回收率在96.4%-111.1%之间。5.3线性范围内,剂量-反应曲线线性相关系数,r=0.9994。5.4检测浓度高达5000IU/mL的样品未出现HOOK效应,但是对于浓度更高的样品,出现发光值反而降低的现象。5.5用HBsAg试剂盒多次测定质控品II,计算质控品检测值的均数、标准差及CV%值,结果CV%=6.04%。5.6试剂盒对HBeAg(160PEI U/mL)和HBcAg(150ng/mL)2种物质的测值均不大于0.04IU/mL,表明不受其干扰。5.7试剂盒对国家参考品进行测定,20份阴性参考品检测符合率(-/-)为20/20,3份阳性参考品符合率(+/+)为3/3。所测得的数据符合国家参考品的要求。5.8在检测时不受甘油三酯(5%)、胆红素(0.32mg/mL)、血红蛋白(3mg/mL)的干扰。极高含量的血红蛋白(≥6mg/mL)对测值会有明显影响(偏差>15%),故尽量避免使用严重溶血的标本。5.9试剂盒放置于37℃7天,各项性能指标均符合要求,稳定性较好；6.临床考核的结果：本次研究共检测标本1067例,其中阳性病例606例,与对照方法相比,本试剂盒的灵敏度为99.01%,特异度为99.34%,总符合率为99.2%,从定量测定值考察,与临床值的相关系数为0.921(P<0.01)相关性良好。表明试剂盒可靠,准确,安全,简便,稳定,具有较高的临床应用价值。(二)合成感光化合物,制备链霉亲和素化感光微球。1.合成得深蓝色酞青染料为10.3g,收率为60.2%,溶解于甲醇中测定质谱,AV=3,NL：2.26E7,RT：0.72-0.77。m/z：1364.36(M+H),1063.93(M—OSi(hexyl)3)。甲醇溶液中紫外分析测定结果：λmax=674nm,A=0.259,摩尔吸光系数：,[α]18甲醇=1.6E5(160460)(λmax=674nm)。甲苯溶液中紫外分析测定结果：λmax=676nm,A=0.199,摩尔吸光系数：,[α]18甲苯=3.6E5(360687)(λmax=676nm)。质谱及紫外光谱结果与文献报道一致。2.自制感光微球的评价：测定微球直径为241.4nm。与PerkinElmer相应微球相比,荧光值约为其50%。(三)采用双抗原夹心法研制人免疫缺陷病毒抗体时间分辨荧光免疫分析试剂1.包被方法比较的结果表明包被抗原经β-巯基乙醇处理后包被检测信噪比高,效果远优于直接包被。选用抗原经β-巯基乙醇处理后再包被的方法。2.综合考虑本底信号值、信噪比因素,选择0.5μg/mL作为最佳包被抗原浓度,1：300作为标记抗原的最佳稀释度,对标记抗原进行一定量的稀释,最终工作浓度按1：20稀释。3.参考值范围：409份查体者血清,检测荧光值与阴性对照比值平均值(X)为1.06,标准差(SD)为0.21,均值加2个标准差等于1.48,而当检测荧光值与阴性对照比值在2.1以下时,包含了99.0%的样本。据此设定本试剂盒检测时的阳性判定标准为：CUTOFF=阴性对照荧光值×2.1。4.性能评价的结果显示：4.1试剂盒的阴阳性符合率、最低检出限、精密性均符合中国药品生物制品检定所国家标准品所规定的要求：阴性符合率为18/20,阳性符合率为20/20,P11、P12均为强阳性,且P12>P11,P19、P202支HIV-2型抗体阳性样品,全部为阳性反应；精密性参考品,CV=4.3%；6份最低检出限参考品,S2-S6均为阳性反应,且基质血清S1为阴性反应。4.2HIV抗体时间分辨荧光免疫检测试剂盒在检测时不受甘油三酯(体积比5%)、胆红素(0.32mg/mL)、血红蛋白(18mg/mL)的干扰,无假阳性、假阴性出现,特异性符合临床诊断的要求。4.3自制试剂盒检测乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、梅毒螺旋体抗体、RF因子、抗核抗体的阳性样本,结果均为HIV抗体阴性,说明自制试剂盒检测血样时不受这些因素的干扰。4.4自制试剂盒与对照试剂盒对血清、血浆(含抗凝剂)的检测结果均一致,说明自制试剂盒可以适用于血清和血浆(含抗凝剂)的检测。4.5试剂盒放置于37℃7天,各项性能指标均符合要求,稳定性较好；5.临床考核的结果：本次研究共检测标本1016例。阴阳性比例1：0.84。与对照方法相比,本试剂盒的灵敏度为100%,特异度为98.9%,准确度为99.4%,Kappa=0.988。临床研究结果表明本试剂盒可靠,准确,安全,简便,稳定,具有较高的临床应用价值。结论：上述结果表明本研究研制的HBsAg光激化学发光免疫分析试剂、HIV抗体时间分辨荧光免疫分析试剂的各项指标(准确性、灵敏度、精密性、特异性、稳定性等)均能够满足临床检测试剂要求,临床考核合格,可以替代相应的ELISA试剂盒,与市场上价格高昂的进口试剂盒相竞争。研制的链霉亲和素化感光微球,与进口产品性能相近,有望经进一步优化后应用于生产。