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研究背景：胆固醇是动物组织细胞所不可缺少的重要物质,它不仅参与形成细胞膜,而且是合成胆汁酸,维生素D以及甾体激素的原料,对于细胞膜完整性的维持和体内生命活动都具有重要的意义,但体内胆固醇过多会导致高胆固醇血症,对机体产生不利的影响。目前已有研究发现,动脉粥样硬化、静脉血栓形成、胆石症与高胆固醇血症密切相关。3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A (3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A, HMG-CoA)还原酶(HMGCR)位于细胞内质网内,它催化由HMG-CoA还原成甲羟戊酸(Mevalonate, MVA)的反应是整个胆固醇合成途径的限速反应,HMGCR则是胆固醇合成的限速酶。通过调节该酶的活性可维持体内胆固醇的稳定。HMGCR在肝脏高水平表达,肝脏在调节机体胆固醇代谢方面发挥中心的作用已成共识。HMGCR在多个水平上受到调节,包括转录水平、翻译水平、酶的降解、磷酸化/去磷酸化修饰和产物反馈抑制等。研究发现,HMGCR的磷酸化/去磷酸化修饰在调节胆固醇合成中发挥了重要作用。HMGCR在细胞液中经蛋白激酶催化发生磷酸化丧失活性,而在磷蛋白磷酸酶作用下又可以脱去磷酸从而恢复酶活性。有研究表明,AMPK是肝脏中磷酸化]3MGCR的主要激酶,它可以磷酸化HMGCR 871位点的丝氨酸从而抑制该酶的活性。临床上发现,亚临床甲状腺功能减退症的患者,血清促甲状腺素(thyrotropinor thyroid stimulating hormone, TSH)水平升高而甲状腺激素水平正常,测血脂谱发现血清总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)水平增高而高密度脂蛋白(HDL)降低。一些大型流行病学调查研究也发现在亚临床甲减时TSH与TC相关。例如,Turha报道在亚临床甲状腺功能减退时血清TSH与TC有明显相关性(r=0.52；p=0.001)。说明TSH与血清胆固醇升高有一定联系。促甲状腺素受体(thyrotropin receptor, TSHR)是人体内介导TSH调控功能的重要的蛋白分子。大量研究表明,TSHR不仅在甲状腺细胞表面表达,而且广泛表达于非甲状腺组织细胞内,如脂肪细胞、成纤维细胞、淋巴细胞、骨细胞及神经细胞等,且在这些细胞内发挥重要的病理生理作用。研究已证实,肝脏作为机体内最重要的组织器官之一,在肝细胞表面亦有功能性的TSHR的表达并且TSH可通过cAMP/PKA/CREB信号通路促进肝脏HMGCR表达,增加肝脏胆固醇的合成,而TSH是否对HMGCR的磷酸化/去磷酸化修饰有影响尚未见报道。研究目的：1、TSH是否对肝脏HMGCR磷酸化修饰有影响。2、探讨TSH调节肝脏HMGCR磷酸化修饰中的可能机制,观察PKA、AMPK在其中的作用。研究方法：1、为了研究TSH是否对肝脏HMGCR磷酸化修饰有影响,实验用不同浓度的牛TSH(bTSH)刺激小鼠肝脏原代细胞及人肝癌细胞株HepG2细胞,检测p-HMGCR及HMGCR的蛋白表达。2、为了研究TSH是否对肝脏AMPK有影响,实验用不同浓度的bTSH刺激小鼠肝脏原代细胞及人肝癌细胞株HepG2细胞,检测p-AMPK及AMPK的蛋白表达。3、为了探讨TSH降低肝细胞HMGCR磷酸化表达是否通过调节AMPK的活化来实现,HepG2细胞转染持续激活AMPK质粒(CA-AMPK),再用bTSH刺激肝细胞,检测p-HMGCR和HMGCR蛋白表达的变化。4、为了探讨PKA在TSH降低肝细胞AMPK及HMGCR磷酸化表达中的作用,用PKA抑制剂H89预孵HepG2细胞,再用bTSH刺激肝细胞,检测p-HMGCR、HMGCR、p-AMPK及AMPK的表达变化。5、建立亚临床甲减小鼠模型,检测血清中胆固醇的变化,并检测肝脏中p-HMGCR、HMGCR、p-AMPK及AMPK的表达变化。6、建立Tshr-KO小鼠动物模型,检测肝脏p-HMGCR、HMGCR、p-AMPK、 AMPK的表达变化,探讨TSH是否通过TSHR调节HMG-CoA还原酶的磷酸化修饰。研究结果：1、TSH降低肝细胞HMGCR磷酸化表达(1)与对照组相比,1μM、4μM bTSH处理小鼠肝脏原代细胞,细胞内p-HMGCR蛋白表达均降低,而HMGCR的蛋白表达增加,并且p-HMGCR/HMGCR比值均降低,差异有统计学意义(p<0.05)。说明bTSH可剂量依赖性地降低HMGCR磷酸化水平。(2)与小鼠肝脏原代细胞相似,与对照组相比,1μM、4μM bTSH处理HepG2细胞,Wester blotting示细胞内p-HMGCR蛋白水平及p-HMGCR/HMGCR比值均呈剂量依赖性降低。2、TSH通过抑制肝脏AMPK活化降低HMGCR磷酸化·(1)与对照组相比,1μM、4μM bTSH处理小鼠肝脏原代细胞,细胞内p-AMPK蛋白表达均降低(p<0.05),而AMPK的蛋白表达无明显变化。说明bTSH可剂量依赖性地降低AMPK的活化水平。(2)与小鼠肝脏原代细胞相似,与对照组相比,1μM、4μM bTSH处理HepG2细胞,Wester blotting示细胞内p-AMPK蛋白水平亦呈剂量依赖性降低。(3)转染CA-AMPK质粒的HepG2细胞,再给予bTSH刺激48小时。我们发现,持续激活AMPK能显著抵抗TSH诱导的细胞内p-HMGCR/HMGCR, p-AMPK/AMPK比值降低(P<0.05)。未转染CA-AMPK预处理的HepG2细胞,在TSH刺激48小时后p-HMGCR/HMGCR, p-AMPK/AMPK比值明显降低,但是转染CA-AMPK后,再给予TSH刺激,p-HMGCR/HMGCR, p-AMPK/AMPK比值与仅给予TSH刺激组降低水平明显减少。3、TSH通过PKA降低AMPK的活化及HMGCR的磷酸化用H89预孵HepG2细胞1小时,再给予bTSH刺激细胞48小时。我们发现,H89能显著抵抗TSH诱导的细胞内p-HMGCR/HMGCR, p-AMPK/AMPK比值的降低(P<0.05)。无H89预处理的HepG2细胞,在bTSH刺激48小时后p-HMGCR/HMGCR, p-AMPK/AMPK比值明显降低,但是H89处理后的细胞,在bTSH刺激后,p-HMGCR/HMGCR, p-AMPK/AMPK比值的降低明显减少。4、亚临床甲减小鼠肝脏中HMGCR的磷酸化明显降低(1)与对照组相比,亚临床甲减小鼠血清TSH水平明显增加(P<0.05),但FT3没有明显变化(P>0.05),符合临床上对于亚临床甲状腺功能减退症的诊断标准。亚临床甲减小鼠血清胆固醇水平明显升高(P<0.05)。(2)与对照组相比,亚临床甲减小鼠肝脏HMGCR表达明显增加,而p-HMGCR的表达明显降低,p-HMGCR/HMGCR比值明显降低(P<0.05)。(3)与对照组相比,亚临床甲减小鼠肝脏p-AMPK表达明显降低,而AMPK的表达无明显变化,AMPK的磷酸化明显降低(P<0.05)。5、TSH通过TSHR调节肝脏HMGCR磷酸化(1)与同窝野生型小鼠相比较,Tshr-KO小鼠血清FT4、TT4、TSH均没有明显变化(P>0.05),但血清胆固醇明显降低(P<0.05)。(2)与同窝野生型小鼠相比较,Tshr-KO小鼠肝脏p-AMPK/AMPK, p-HMGCR/HMGCR比值明显升高(P<0.05),p-HMGCR蛋白表达明显增加。结论：TSH通过TSHR激活PKA,抑制肝脏AMPK的活化,从而降低HMGCR的磷酸化水平,揭示了TSH对HMGCR直接作用的又一可能机制。