论文部分内容阅读
化学农药的应用导致了环境问题和社会问题。生物防治是植物真菌病害防治中的一项有效手段,它因为具有对生态环境的有效保护作用和防效潜力,从而得到了国内外人士的认可。近年来荧光性假单胞菌作为生防菌株的开发应用得到了较多关注。某些荧光性假单胞菌(fluorescentPseudomonas,pf)可以产生多种抗生性次级代谢产物,如藤黄绿脓菌素(pyoluteorin,plt)、2,4-二乙酰藤黄酚(2,4-diacetylphloroglucino1,2,4-DAPG,phl)、硝吡咯菌素(pyrrolnitrin,prn)、吩嗪-1-羧酸(phenazine,pca)、卵菌素 A(Oomycin A)、假单胞菌酸(Pseudomonas acid)、生物表面活性剂(biosurfactant)、嗜铁素(siderophores)、氰化氢(HCN)等,从而抑制植物病原微生物的生长。其中,plt、phl、prn、pca由于其防效好目前被广泛研究。环脂肽(cyclic lipopeptid)是一种生物表面活性剂,荧光性假单胞菌产生的环脂肽因其化学结构和作用机制不同于已有所有类别的抗生素,以及其具有抑制多种耐药菌和杀伤肿瘤细胞的活性,使得它成为当今新型抗生素筛选的热点。本文筛选到四株产抗生性次级代谢产物的荧光性假单胞菌,对其展开了菌株鉴定、功能基因的分子水平检测、代谢物质的鉴定等研究。主要研究内容及结果如下:1、从玉米、茄子、辣椒根际土壤中共筛选到199株荧光性假单胞菌,ARDRA分析显示,共有四种分类操作单元(OTU)。拮抗真菌实验表明四株荧光性假单胞菌具有抑真菌活性。LMA-2拮抗大斑凸脐蠕孢(Exserohilumturcicum LeonardetSuggs)和禾旋孢腔菌(Cochliobolussati-vu Drechsl);SXM-13 拮抗核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum(Lib.)de Bary)、苹果黑腐皮壳菌(Valsa mali Miyabe et Yamada)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani Kuhn);SXM-19 拮抗禾旋孢腔菌(Cochliobolus sati-vu Drechsl)和苹果黑腐皮壳菌(Valsamali Miyabe et Yamada);EG-42 拮抗禾旋孢腔菌(Cochliobolus sati-vu Drechsl)。2、利用16SrDNA测序、磷脂肪酸成份分析、环境扫描电镜形态学观察等方法对以上四株菌进行菌种鉴定。其中SXM-19为恶臭假单胞菌,其余三株为假单胞菌属。3、PCR方法检测LMA-2、SXM-13、SXM-19和EG-42与抗生性次级代谢产物合成相关的基因,结果表明,SXM-19具有与环脂肽和phl合成相关的基因,EG-42具有与phl合成相关的基因。化学方法检测表明LMA-2、SXM-13、SXM-19、EG-42都不产HCN及几丁质酶。4、通过排油圈实验和表面张力仪检测表明SXM-19发酵上清液中存在表面活性剂;经TLC显色结果初步确定SXM-19产生了环脂肽;利用SephadexG-25对SXM-19代谢产物进行分离纯化,收集到的物质利用电喷雾质谱方法确定其相对分子质量分别为1207和1168,与文献报道的pseudomycinB和masstolideC/pseudophomin一致。查阅文献发现,恶臭假单胞菌SXM-19是首次发现的可以同时产生两个家族脂肽的菌株。5、对SXM-19产生的两种环脂肽混合物进行MTT实验,发现其对HT1080、Hela、HEK293细胞有杀伤作用。通过本实验,我们获得了 LMA-2、SXM-13、SXM-19和EG-42四株具有拮抗真菌活性的菌株;经菌种鉴定,LMA-2、SXM-13和EG-42归属于假单胞菌属,SXM-19为恶臭假单胞菌。从分子水平确定SX]M-19具有与环脂肽和phl合成相关的基因,EG-42具有与phl合成相关的基因。并对SXM-19产生的环脂肽进行分离纯化,发现该菌株可以产生两个家族的环脂肽。