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研究目的和意义大量临床及实验研究证实,慢性应激在疾病发生、发展过程中扮演重要角色,但慢性应激引起或诱发疾病的确切机制尚未完全明了,因而目前关于抗应激损伤的治疗措施也存在靶向不确定或单一、副作用明显等缺陷,大大限制了该类药物的临床应用。中药复方逍遥散由宋代太医局制定颁布,临床常用于治疗郁证相关疾病,近千年的临床实践证明其疏肝解郁、健脾和营之功效显著,现代实验研究也已证实,逍遥散能够改善或削除心理应激引起的学习记忆能力下降和抑郁、焦虑等症状,具有明确的镇静、镇痛、抗惊厥、抗焦虑及抗慢性抑郁作用。本研究即在总结以往慢性应激损伤机制、逍遥散抗应激损伤相关研究的基础上,提出逍遥散抗慢性应激损伤机制的假说,并围绕这一假说,以体外培养的大鼠海马神经细胞为模型,展开一系列相关实验研究,以期探明慢性应激损伤及逍遥散抗慢性应激损伤可能存在的某种中枢机制。研究方法以体外原代培养的Wistar乳鼠(新生24小时内)海马神经细胞为模型,以正常大鼠血清、慢性应激大鼠模型血清、逍遥散治疗血清以及谷氨酸(Glu)为干预因素,以N-甲基-D-天门冬氨酸受体(NR)非选择性抑制剂地佐环平(MK-801)为工具药,研究慢性应激状态下以及逍遥散治疗对大鼠海马神经细胞存活率、NR各亚其mRNA的表达、海马神经细胞内游离钙离子浓度、糖皮质激素受体蛋白表达的影响,探讨中药复方逍遥散抗慢性应激损伤的作用以及可能存在的中枢作用机制。1大鼠海马神经细胞体外原代培养与鉴定：无菌条件下急性分离新生24小时内的Wistar大鼠乳鼠海马组织,用胰蛋白酶消化与机械吹打相结合的方法分离海马神经细胞,以含血清的培养基种植、无血清饲养液维持饲养,神经微管相关蛋白-2(Map-2)鉴定神经元纯度。2慢性应激模型大鼠血清、逍遥散治疗血清的制备：实验动物随机分为3组：正常对照组(每天每只灌胃生理盐水2ml,不进行应激刺激)、慢性应激模型组(每天每只灌胃生理盐水2ml后,进行应激刺激)、逍遥散组(每天每只灌胃逍遥散水煎剂2ml/后,进行应激刺激),采用Cart的多相性应激模型并加以改进,应激源包括：足底电击(电压30V,电击频率0.1Hz,每次持续1s,共30次)、冰水游泳(4℃左右,5min)、禁水(24h)、禁食(24h)、束缚(4h),每天不定时随机安排一种应激刺激,避免相邻两天出现重复,避免形成规律性及造成大鼠适应性,连续21天。于末次给药1-2h后麻醉条件下腹主动脉采血,血液以3000rpm离心,分离血清,每组血清分别混合后于56℃水浴中灭活30min。置超净台内,无菌条件下以0.22μm滤器抽滤除菌,按1ml分装并标记,-20℃冰箱保存备用。3分组处理后Glu-NR-Ca2+-cAMP-iGR信号通路相关指标检测：细胞培养至第8d分为7组：(1)空白对照组(正常细胞,不做任何处理)、(2)正常血清对照组、(3)正常血清+Glu组、(4)模型血清+Glu组、(5)模型血清+Glu+MK801组、(6)逍遥散治疗血清+Glu组、(7)逍遥散治疗血清+Glu+MK801组。每组均先以制备的血清或和MK-801预处理20min,再加入Glu作用30min。以常规MTT法检测各组细胞存活情况；采用Taqme.n荧光探针定量PCR法测定各组Ct值,2-△△Ct相对定量法计算NR各亚基表达量相对值；在同一时间段内,通过激光共聚焦显微镜技术对模拟慢性应激微环境下以及逍遥散治疗血清干预后大鼠海马神经细胞内游离钙离子浓度进行检测；采用免疫印迹法检测慢性应激大鼠模型血清以及逍遥散治疗血清干预体外培养的海马神经细胞后,其胞内糖皮质激素受体(iGR)表达情况。研究结果1培养8天,神经元胞体清晰,结构完整,神经元纯度最高达到85.71%,平均为75.32%。2各组细胞存活率相当。第(3)组(正常血清+Glu组)与第(4)组(模型血清+Glu)细胞存活率相对较低,其余各组无统计学差异。3模型血清与谷氨酸模拟的慢性应激微环境下神经细胞存活率明显降低,海马神经细胞NR各亚基mRNA出现不同程度的表达上调,细胞内Ca2+浓度显著升高,iGR表达明显下调。4在拟慢性应激作用前对细胞进行MK-801预处理,即阻滞NR后,细胞存活率与空白对照组比较无统计学差异,NR2AmRNA、NR2BmRNA表达水平明显降低,但尚未达到正常水平,胞内Ca2+浓度虽有明显降低,但未能更显著地改善Ca2+内流增加的状况,也未能完全阻断iGR的表达下调。5逍遥散治疗血清干预后,细胞存活率有升高趋势,NR2AmRNA表达明显上调,NR2BmRNA表达水平较慢性应激组显著降低,而NR1mRNA表达无明显下降,神经细胞内Ca2+浓度显著降低,iGR的表达下调有所改善,但与空白组比较还存在差异。6 MK-801与逍遥散治疗血清共同作用后,细胞存活率与空白组比较无显著性差异,NR2AmRNA、NR2BmRNA表达量接近正常,Glu未能引发Ca2+内流增加,与空白对照组无统计学差异,其对抗iGR含量降低的作用倾向更加显著。研究结论1以新生24h内Wistar乳鼠为供体,采用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基种植,以Neurobasal配合B27进行无血清饲养的原代大鼠海马神经细胞培养法,无需阿糖胞苷纯化细胞,培养至第8d可以获得纯度最大值达到85.71%,平均为75.32%的神经元,能够满足纯度要求不太高,而细胞量较大的实验需要,是适合进行多种细胞水平研究的良好模型。2使用慢性应激动物模型血清加谷氨酸能够模拟慢性应激状态,可以导致NR过度激活从而出现细胞内钙超载,继而引起iGR合成减少,对海马神经元造成了类似于慢性应激损伤的病理结果。3逍遥散治疗血清能够纠正NR各亚基表达失衡的状态,促进机体恢复或保持NR2A与NR2B的正常比例,维持胞内钙稳态,对抗慢性应激导致的iGR表达下降,对维持海马神经细胞的稳定起到一定作用,从而发挥了保护神经元、对抗慢性应激损伤的作用。4 MK-801不能完全阻滞本实验模拟的慢性应激微环境引起的钙超载和iGR表达量下降,还存在通过Glu-NR以外其他信号转导通路的共同作用。与逍遥散治疗血清共同作用后,除MK-801抑制NR激活外,逍遥散治疗血清发挥了保持NR正常数量及活性,抑制Ca2+超载,维持胞内钙稳态,对抗iGR表达减少,从而保护神经元免受兴奋性毒性损伤的作用,这种保护性作用可能与其中某些有效成分阻滞了包括Glu-NR-Ca2+-iGR在内的多种信号通路有关。小结慢性应激大鼠模型血清与Glu共同作用能够模拟慢性应激状态,可以导致NR过度激活从而出现细胞内钙超载,继而引起iGR合成减少,对海马神经元造成了类似于慢性应激损伤的病理结果。逍遥散治疗血清能够纠正NR各亚基表达失衡的状态,促进机体恢复或保持NR2A与NR2B的正常比例,维持胞内钙稳态,对抗慢性应激导致的iGR表达下降,对维持海马神经细胞的稳定起到一定作用,在慢性应激条件下发挥了保护神经元、对抗慢性应激损伤的效应。MK-801工具药的使用使我们了解到逍遥散治疗血清可能从包括Glu-NR-Ca2+-cAMP-iGR的多种信号途径发挥这种抗慢性应激损伤作用。