肺癌是世界上死亡率最高的恶性肿瘤之一,其中超过80%的是非小细胞肺癌。虽然近年来外科手术、放疗和化疗方面的进展在一定程度上提高了肺癌患者的生存时间和生存质量,但肺癌的5年生存率仍然只有14%,而且患者确诊为肺癌时多已发生远端转移。早期诊断率低、肺癌细胞对常用化疗药物的固有或继发性耐药和高的肿瘤转移率是导致治疗失败的重要原因。因此,临床上迫切需要高效低毒的新药。力达霉素（Lidamycin,LDM）是本研究所从一株放线菌（Streptomycesglobisporus C-1027）代谢产物中获得的对多种肿瘤细胞有强烈杀伤作用的大分子肽类抗肿瘤抗生素。大量研究表明,LDM对多数肿瘤细胞及移植瘤具有极强的抗肿瘤活性,这都源于LDM对DNA的强烈地切割作用。最近研究显示LDM可引起肿瘤细胞染色体畸变及端粒功能异常。目前正在进行临床Ⅱ期试验研究。本课题选用3种人非小细胞肺癌A549,H460及H157细胞株,探讨LDM体外体内对人非小细胞肺癌的影响及其作用机制。此外,本课题还初步研究了LDM联合gefitinib对表达不同水平EGFR的A431细胞及H460细胞的影响,并比较了两药对H460移植瘤的抑制作用,从而为LDM联合gefitinib的临床应用提供依据。一、LDM作用于非小细胞肺癌的体外实验研究1、MTT结果显示LDM显著抑制人表皮样癌A431、人肺腺癌A549、人大细胞肺癌H460、人肺鳞癌H157、人巨细胞性肺癌801D及人高转移性巨细胞肺癌PG等肿瘤细胞的增殖。LDM对这些细胞的IC₅₀值分别为1.12×10^-10±1.10×10^-10M、3.65×10^-12±2.94×10^-12M、2.41×10^-12±1.15×10^-12M、1.24×10^-10±1.14×10^-10M、5.66×10^-12±1.13×10^-12M、2.40×10^-11±1.16×10^-11M,细胞增殖抑制作用显著强于常用抗肿瘤化疗药。2、Hoechst33342荧光染色法和Annexin V-FITC/PI染色法结合流式细胞仪检测LDM对H460、H157、A549细胞凋亡的诱导作用。结果显示不同浓度LDM作用细胞48 h后,细胞凋亡率剂量依赖性地增高。H460细胞对LDM的凋亡诱导作用最敏感,0.5 nM的LDM可诱导43.30±4.26%的H460细胞发生早期凋亡,2 nM剂量下可以产生69.87±3.29%的凋亡细胞。LDM也可显著诱导H157细胞及A549细胞发生早期凋亡,但凋亡程度较H460弱。荧光显微镜下可见1 nM、5 nM LDM组的细胞出现染色质凝集、细胞核固缩、形成凋亡小体等典型的凋亡细胞形态学改变。TUNEL法检测结果也显示,LDM可剂量依赖地诱导H460及H157细胞凋亡。3、PI单染结合流式细胞仪检测LDM对细胞周期的影响。结果显示,小于1 nM的LDM主要将细胞阻滞于G2/M期,1 nM及2 nM LDM可同时引起S期和G2/M期阻滞。同时检测的SubG1细胞剂量依赖地增加也证实了LDM对凋亡的诱导作用。在1 nM、2nM剂量下,LDM可分别引起H460细胞39.45±3.75%及52.55±4.45%的细胞产生Sub-G1峰,同样剂量的LDM也显著诱导H157及A549细胞的凋亡,但凋亡的程度不如H460细胞的显著。4、Western bloting法检测了LDM对细胞周期及凋亡相关蛋白的影响。结果显示LDM剂量依赖地诱导3种非小细胞肺癌细胞Caspase-3、Caspase-7的活化及PARP的切割,显著下调凋亡抑制蛋白Bcl-2及NF-κB的水平,诱导细胞产生caspase介导的凋亡。同时LDM还可上调p53及p21蛋白的表达及下调CyclinB1蛋白的表达,引起G2/M期阻滞。5、利用Transwell实验观察LDM对非小细胞肺癌细胞的迁移和侵袭能力的影响。实验结果显示,LDM对3种非小细胞肺癌细胞的迁移和侵袭能力均有显著的抑制作用,并呈明显的剂量依赖关系。6、利用明胶酶谱法观察LDM对3种非小细胞肺癌细胞基质金属蛋白酶的影响。结果显示,LDM可剂量依赖地显著抑制各细胞MMP-9的分泌,并显著抑制H157细胞MMP-2的分泌及活化,而对H460及A549细胞的MMP-2无显著影响,进一步证实了LDM的抗侵袭迁移的能力。7、Western bloting法测定了LDM对侵袭和迁移相关靶点分子的影响。结果显示LDM可剂量依赖地下调3种非小细胞肺癌细胞KDR,VEGF,COX-2,及MMP-9、MMP-2的表达及活性,但下调的程度不尽相同。8、Western bloting法结果显示LDM可通过影响3种非小细胞肺癌细胞EGFR信号通路各信号分子的磷酸化水平从而起到抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡、周期阻滞及抗侵袭的作用。虽然LDM对于3种细胞EGFR通路上多数信号分子产生不同的效应（可能与细胞的类型不同有关）,但经LDM处理后3种细胞最显著的相同之处为RAF/MEK/ERK通路的激活,即LDM剂量依赖地增强了MEK及ERK的磷酸化水平。9、Western bloting法及Annexin V-FITC/PI双染法结果显示MEK抑制剂U0126可部分消除LDM引起的ERK的活化,同时也可减轻LDM诱导凋亡的程度,说明ERK通路参与了LDM的凋亡诱导作用。二、LDM作用于非小细胞肺腺癌的体内实验研究利用人肺腺癌A549裸鼠移植瘤模型检测LDM的体内抗肿瘤作用。LDM剂量为0.02 mg/kg的抑瘤率为39.5%,0.04 mg/kg的抑瘤率为57.6%,与对照组相比有显著性差异。三、LDM与gefitinib联合作用的体外实验研究1、MTT法观察了gefitinib对A549、H460、H157及A431细胞的增殖抑制作用。Gefitinib对EGFR高表达A431细胞的IC₅₀值为0.28±0.03μM,远小于对EGFR表达适中的3株非小细胞肺癌细胞的IC₅₀值（16.04±2.96μM～19.57±6.6μM）。选择对gefitinib最不敏感的H460细胞及最敏感的A431细胞进行后续的联合作用的研究.2、MTT法比较了三种联合给药顺序对人H460细胞的联合抑制作用。结果显示先加LDM,8 h后加gefitinib联合效果较好。多数联合剂量有协同增殖抑制作用（CDI＜1）,其中0.1 nM LDM与5μM gefitinib联合作用时,对H460细胞协同增殖抑制作用非常显著（CDI＜0.70）。同样经过这种给药方案处理后,一定的联合剂量下两药对A431细胞有协同增殖抑制作用,其中0.01 nM LDM与0.1μM gefitinib联合对A431细胞具显著地协同增殖抑制作用（CDI＜0.70）。3、用Annexin V-FITC/PI双染结合流式细胞术检测LDM与gefitinib对H460及A431细胞的凋亡诱导作用。结果显示随着两药剂量的增加凋亡细胞的比率渐增。LDM显示了强大的凋亡诱导作用,2 nM的LDM可分别诱导69.87±3.29%（P＜0.001）的H460细胞、63.2±1.39%（P＜0.001）的A431细胞发生凋亡。而gefitinib对敏感细胞A431的凋亡诱导作用较强。1μM的gefitinib诱导30.70%±1.69%（P＜0.01）的A431细胞发生凋亡;而对不敏感细胞H460,20μM gefitinib仅引起13.60±1.37%（P＜0.05）的细胞发生凋亡。4、Annexin V-FITC/PI染色法观察两药联合对凋亡的诱导作用。结果显示在低剂量组合下,0.01 nM的LDM与0.1μM的gefitinib联合对A431的凋亡诱导率为31.87%,明显高于两药单独作用引起的凋亡率6.71%及12.79%;在高剂量组合下,0.1 nM的LDM与1μM的gefitinib联合对A431的凋亡诱导率为53.93%,明显高于两药单独作用引起的凋亡率21.45%及31.89%。Gefitinib单药对H460细胞的凋亡诱导作用较弱,但LDM可增强gefitinib对于凋亡的诱导作用。0.5 nM的LDM与20μM的gefitinib联合对H460细胞的凋亡诱导率为53.85%,高于两药单独作用引起的凋亡率42.88%及12.63%。以上结果说明联合用药对gefitinib敏感细胞的凋亡诱导率显著高于单独用药,不敏感细胞联合用药后显示略强于单独用药的凋亡诱导作用。5、Western bloting法测定单药及联合用药对PARP的切割作用及对凋亡抑制蛋白NF-κB的作用。在A431细胞中观察到gefitinib剂量依赖地增强了PARP的切割。两药联合引起PARP切割的显著增强。然而,在试验剂量下,gefitinib几乎不能引起H460细胞的PARP切割。两药联合作用后的效果与LDM单药相似,仅在10μMgefitinib与0.5 nM LDM联合作用时才显示略强于单药的作用。联合用药可显著降低两种细胞的NF-κB水平,从而增强了单药的凋亡诱导作用。6、Western bloting法检测了联合用药对H460及A431细胞EGFR通路信号分子的影响。结果显示0.01 nM的LDM与0.1μM、1μM gefitinib联合较单药显著地降低了A431细胞p-EGFR,p-ERK及p-Akt水平。对于H460细胞,在0.5 nM LDM与10μM gefitinib剂量组合下,联合作用较单药可略微降低p-EGFR的水平,但联合用药可显著抑制EGF引起的H460细胞EGFR及AKT磷酸化水平的增高。四、LDM与gefitinib对于大细胞肺癌H460裸鼠移植瘤的抑制作用利用人大细胞肺癌H460裸鼠移植瘤模型检测LDM的体内抗肿瘤作用。结果显示,LDM和gefitinib对H460移植瘤的生长均有抑制作用,并且LDM显示出更强的抑瘤效果。0.025 mg/kg、0.05 mg/kg的LDM对移植瘤的抑瘤率分别为52.8%及72.4%,与生理盐水对照组相比有显著性差异。50 mg/kg的gefitinib的抑瘤率为69.4%,与0.5%Tween 80溶剂对照组相比有显著性差异,与可耐受剂量0.05mg/kg LDM组抑制作用相当。