论文部分内容阅读
小电导钙激活钾通道（small conductance Ca2+activated K+channels,KCa2,SK）属于非电压依赖性的钙激活钾通道家族,主要分布于神经系统和心血管系统,对Ca2+的敏感性远高于大电导钙激活钾通道（big conductance Ca2+activated K+channels,BK）,可至亚微摩尔级。Ca2+通过与SK通道羧基端钙调蛋白（calmodulin,Ca M）结合激活通道,K+外流从而使细胞内钙离子稳态的变化转换成细胞膜电位变化。SK通道可分为三个亚型,SK1、SK2及SK3,其中SK2通道主要表达于心房,参与心肌细胞动作电位复极化形成,在生理和病理状态下起关键作用。敲除小鼠SK2通道可延长动作电位复极化的时程,房颤的易感性增加;过表达SK3通道可使动作电位复极化缩短,亦增加房颤发生。由此提示,SK通道可作为治疗房颤等心血管疾病的靶点,但其分子调控机制,目前所知甚少。Junctophilins（JPs）在哺乳动物可兴奋细胞中可维持内质网/肌质网（endoplasmic reticulum/sarcoplasmic reticulum,ER/SR）与质膜之间的紧密联系。哺乳动物体内有JP1-4四个亚型,其中JP1主要在骨骼肌表达,JP2存在于骨骼肌、心肌和平滑肌细胞,JP3和JP4主要定位在中枢神经系统。在神经系统中的研究显示,敲除JP3和JP4可使Ry R2通道失去对SK2通道的调控作用;在骨骼肌和心肌中,敲除JP1和JP2可使L型钙通道（L-type voltage-dependent calcium channels,LTCC）与Ry R2通道（ryanodine receptor2）失偶联,骨骼肌和心肌收缩异常。高分辨率光学显微镜下观察到JP2与Ry R2之间紧密联系,JP2通过与Ry R2通道直接作用调节通道门控。敲除JP2也可影响钠钙交换体（sodium Calcium Exchanger,NCX1）的定位及功能。此外,JP2和Caveolin1蛋白之间的结合为血管平滑肌的质膜与肌质网膜耦联的钙微区（Ca2+microdomain）提供结构和功能基础,并维持Ry R2和BK通道之间的功能耦联;JP2与Caveolin3蛋白直接相互作用可调控新生小鼠耦联膜复合体（junction membrane complex,JMC）的成熟发育。由此可见,JP2作为心肌细胞中的“桥梁”蛋白,其与离子通道之间有效的信号传导为钙诱导钙释放过程（calcium-induced calcium release,CICR）和心肌正常收缩奠定基础,具有重要的生理意义。位于JP2氨基端的MORN（membrane occupation and recognition nexus）结构域,是与质膜偶联的特定功能结构域,由MORN结构域I和II组成。对于MORN结构域与质膜相互作用的机制有不同的研究,可能通过与质膜磷脂分子直接结合,或通过与细胞膜蛋白分子等进行结合。我们实验室之前结果证实小鼠心肌JP2蛋白与SK2通道有相互作用,那么JP2是否通过MORN结构域与SK2发生相互作用,以及它与SK2通道结合的具体结构域,目前尚未见报道。本研究根据文献报道及JP2和SK2的结构特点,制备SK2和JP2的不同片段质粒,采用分子生物学和细胞生物学的方法,检测二者结合的具体区域;观察JP2 MORN结构域对SK2通道表面膜表达的影响及第一部分JP2蛋白与SK2通道相互作用区域的验证材料与方法1.免疫共沉淀和细胞免疫荧光检测SK2和JP2的定位及相互作用:大鼠心肌组织或细胞裂解液中加入JP2或SK2抗体,用protein A/G珠子制备免疫共沉淀复合物,分析SK2和JP2蛋白之间的相互作用。制备H9c2细胞爬片,细胞免疫荧光观察SK2和JP2蛋白在细胞中的分布。2.构建SK2和JP2片段真核表达载体:将SK2不同片段SK2-N（1-145）,SK2-M（141-390）和SK2-C（380-574）克隆至载体p IRES2-EGFP中,并在C末端插入Flag/HA标签。不同长度的JP2 c DNA:JP2-N1（1-253,包含MORN I结构域）,JP2-N2（216-350,包含MORN II结构域）,JP2-C（340-696）克隆至有His标签p EGFP-C1载体中。3.免疫共沉淀检测SK2和JP2片段相互作用:分别将SK2-N,SK2-M及SK2-C与JP2-N1,JP2-N2及JP2-C两两按1:1比例瞬时转染HEK293细胞后提取各转染组细胞总蛋白,使用特异性标签Flag和His抗体,分析SK2片段与JP2片段是否结合。4.GST pull-down分析:分别将GST-JP2-N1,GST-JP2-N2,GST-JP2-C及对照GST原核表达载体转化BL21菌株,IPTG诱导融合蛋白表达及纯化。将各组纯化蛋白与HEK293细胞中表达的SK2-X-HA片段蛋白孵育,谷胱甘肽洗脱液特异性洗脱后用Western blot检测复合物中HA标签表达。结果1.SK2和JP2可在大鼠心肌及H9c2细胞中形成免疫沉淀复合物,并且二者在H9c2细胞中分布于细胞膜及胞浆中,有明显的共定位。提示SK2通道和JP2蛋白可能存在相互作用。2.免疫共沉淀实验结果显示JP2-N1与SK2-C末端可直接相互作用,其余实验组及对照组均未出现免疫阳性条带。3.GST-pulldown实验结果显示大肠杆菌BL21中表达的GST-JP2-N1融合蛋白可与HEK293细胞中表达的SK2-C末端蛋白结合,该结果提示JP2通过MORN结构域I与SK2羧基端发生相互作用。第二部分JP2 MORN结构域Ⅰ增加细胞膜SK2通道的表达和定位材料与方法1.构建SK2+JP2-N1、SK2+JP2-N1mut点突变真核表达载体:将SK2和JP2-N1的c DNA亚克隆至p IRES2-EGFP中,得到SK2+JP2-N1质粒。采用点突变技术在SK2+JP2-N1质粒中构建N101R和Y141H两个突变位点。2.HEK293稳定转染细胞株表达筛选:分别将SK2,SK2+JP2-N1和SK2+JP2-N1mut质粒转染HEK293细胞,G418筛选,阳性克隆出现后采用有限稀释法扩大培养,提取总细胞RNA,RT-PCR检测目的基因。3.生物素提取细胞膜蛋白:将转染各组质粒的HEK293细胞表面生物素化,裂解细胞蛋白,生物素结合的蛋白与亲和素珠子孵育后还原洗脱蛋白复合物,W estern blot检测各组细胞的SK2通道蛋白表达。4.敲减JP2腺病毒构建及感染:将接种于培养皿中的H9c2细胞用携带阴性对照si RNA（Ad-NC）或JP2-si RNA（Ad-si JP2）的腺病毒感染。RT-q PCR和Western blot的方法分别测定各组感染细胞中JP2 m RNA和蛋白表达,并观察JP2敲减对SK2通道总蛋白及膜蛋白表达的影响。5.免疫共沉淀检测JP2 MORN结构域I突变对其与SK2通道结合的影响。6.电生理记录:选择稳定转染SK2和SK2+JP2-N1质粒的HEK293细胞作为研究对象,全细胞膜片钳记录SK2通道电流。结果1.建立HEK293稳定表达SK2、SK2+JP2-N1和SK2+JP2-N1mut细胞株,提取各转染细胞组SK2通道总蛋白和膜蛋白,Western blot结果显示,与单转SK2组相比,SK2+JP2-N1组SK2通道的总蛋白没有显著变化,膜蛋白显著增加;转染SK2和SK2+JP2-N1 mut两组比较,SK2总蛋白与膜蛋白均无显著差异。细胞免疫荧光实验结果显示,转染SK2的HEK293细胞,SK2通道分布于胞浆中;转染SK2+JP2-N1质粒的HEK293细胞,SK2通道的膜蛋白分布显著增加,该结果提示JP2 MORN结构域I可显著增加SK2通道的膜表达和定位。2.分别用JP2敲减si RNA及阴性对照si RNA感染H9c2细胞,提取H9c2细胞的总蛋白及膜蛋白,与阴性对照组相比,JP2敲减si RNA组SK2通道的总蛋白无明显变化,膜蛋白表达显著降低。3.分别取表达SK2+JP2和SK2+JP2mut稳定转染HEK293细胞株,用特异性SK2和JP2抗体进行免疫共沉淀实验,结果显示JP2突变显著降低其与SK2通道之间的结合。4.全细胞膜片钳记录不同稳转细胞组的SK2通道电流,与转染SK2质粒的HEK293细胞相比,转染SK2+JP2-N1质粒的HEK293细胞中SK2电流密度明显增加。第三部分JP2 MORN结构域Ⅰ调控细胞膜SK2通道表达的机制材料与方法1.RT-q PCR检测H9c2细胞中敲减JP2对SK2 m RNA表达的影响。2.细胞免疫荧光检测转染SK2+JP2-N1mut质粒的HEK293细胞中SK2通道在核内体及高尔基体中定位。3.Western blot方法检测伯氨喹处理转染SK2+JP2-N1或SK2+JP2-N1mut质粒的HEK293细胞中SK2通道膜表达。4.统计学分析:所有实验数据以均数±标准误表示,图形均使用Graph Pad Prism 5软件创建。以两样本均数t检验进行统计学处理,P<0.05为差异有统计学意义。结果1.在稳定表达SK2+JP2-N1 mut质粒的HEK293细胞株中,SK2通道与早期核内体标记物Rab5、EEA1共定位明显,而与高尔基体标记物GM130共定位较弱。该结果提示JP2 MORN结构域I突变可能使SK2聚集于早期核内体致使其转运至细胞膜发生异常。2.用选择性抑制SK2通道循环转运途径的伯氨喹处理表达SK2+JP2-N1和SK2+JP2-N1mut质粒的HEK293细胞,Western blot结果显示,与DMSO组比较,伯氨喹处理组的SK2通道膜蛋白均显著降低。进一步提示JP2 MORN结构域I可能通过影响逆向转运通路中的循环途径降低SK2通道膜表达。结论JP2 MORN结构域I通过与SK2羧基末端的相互作用直接调节SK2通道的功能和转运。