羟基红花黄色素A促进兔激素性股骨头缺血性坏死修复机制的研究

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目的:观察活血化瘀中药红花主要有效成分羟基红花黄色素A对激素诱导兔股骨头缺血性坏死的修复作用,从MAPK信号通路探讨其作用机制,为防治激素性股骨头缺血性坏死提供理论依据。方法:1.采用贺氏造模法,通过对新西兰兔臀肌注射醋酸泼尼松龙建立兔激素性股骨头缺血性坏死模型,并通过透射电镜观察、组织形态学观察、空骨陷窝率计算等方面进行鉴定。2.造模成功后,将实验动物随机分为5组,分别采用不同方法进行干预。空白组:正常饲料喂养;对照组A:髓芯减压+生理盐水50μl局部注射;对照组B:耳缘静脉注射生理盐水2ml/d;治疗组A:髓芯减压+羟基红花黄色素A50μl局部注射;治疗组B:耳缘静脉注射羟基红花黄色素A2ml/d。3.上述5组动物于干预2周后取出股骨头,行透射电镜、组织形态学观察、空骨陷窝率计算、ALP检测、PCR法检测I型胶原表达、免疫组化法检测MAPK信号通路JNK的表达、Western blot法对MAPK信号通路相关蛋白ERK1、ERK2、P38的表达进行分析检测。结果:1.光镜观察:空白组股骨头软骨层较厚,成骨活跃,骨小梁排列较规则,骨细胞清晰可见,核较大,多位于中央,偶见骨陷窝空虚,髓腔内可见增生活跃的骨髓组织。对照组股骨头软骨层较薄,软骨下骨小梁变细,结构紊乱,部分有断裂现象,骨陷窝空虚现象明显增多,骨细胞减少,脂肪细胞增多,且髓腔几乎完全为脂肪组织代替。治疗组股骨头软骨层明显增厚,软骨下骨小梁变粗,排列较规则,骨细胞增生活跃,核大居中,脂肪细胞减少、变小,骨陷窝空虚现象明显减少,髓腔内可见增生活跃的骨髓组织逐渐取代脂肪组织。2.电镜超微结构观察:空白组骨细胞形态基本正常,胞内细胞器比较完整,胞浆丰富,未见明显脂滴;对照组骨细胞结构模糊不清,数量减少,多发生退变坏死,胞核固缩,骨细胞内有大小不等、多少不一的脂滴出现,胞核被挤向一侧;治疗组骨组织表面有一层梭形成骨细胞覆盖,骨细胞细小,核仁可见,浆少,有少量线粒体及粗面内质网、溶酶体,个别骨细胞结构模糊不清,细胞内脂滴明显减少或消失。3.空骨陷窝率计算:空白组空骨陷窝率较低,为14.38%;对照组空骨陷窝率明显增高,A高达26.43%、B高达25.47%;治疗组空骨陷窝率与对照组相比明显降低,A为14.63%、B为16.32%。4.ALP检测:对照组比空白组ALP含量明显降低,而羟基红花黄色素A治疗组比对照组含量明显升高,且治疗组中A与B相比有差异。与对照组A、B相比,治疗组A、B的ALP含量均有明显升高。5. RT-PCR检测:对照组比空白组I型胶原表达均有明显下调,而羟基红花黄色素A治疗组比对照组I型胶原表达均有明显升高,且治疗组中A与B相比无显著差异。与对照组A、B相比,治疗组A、B的I型胶原表达均有明显升高。6.免疫组化:对照组、治疗组JNK表达比空白组均有上调,而对照组上调更加明显。治疗组与对照组相比JNK表达均有显著降低。7. MAPK信号转导相关蛋白表达:通过Western blot法对MAPK信号通路相关蛋白ERK1、ERK2、P38的表达进行分析检测,发现对照组与空白组相比,P-ERK1、P-ERK2的表达明显下调,而P-P38的表达则明显上升。治疗组与对照组相比,P-ERK1、P-ERK2的表达均明显上升,而P-P38的表达则明显下降。同时P-ERK1、P-ERK2的表达在治疗组A、B之间差异显著,而P-P38蛋白表达差异不明显。结论:1.通过对股骨头组织进行透射电镜、组织形态学观察、空骨陷窝率计算、ALP检测、以及I型胶原表达的检测,表明羟基红花黄色素A可促进BMSCs的成骨分化,有利于坏死股骨头骨组织的修复。2.通过实验发现髓芯减压联合局部注射HSYA比单纯耳缘静脉注射HSYA对坏死股骨头的修复作用更强,表明两者联合治疗激素性股骨头缺血性坏死可能与通过减轻骨内压,改善局部血液循环同时通过活血化瘀,促进BMSCs的成骨分化,加快破损骨组织修复有关。3.羟基红花黄色素A对激素性股骨头缺血性坏死的治疗作用可能是通过激活MAPK信号通路,调节相关因子ERK1、ERK2、JNK、P38的表达,从而达到抑制骨髓基质细胞向脂肪细胞转化促进其向成骨细胞转化实现的。
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