研究背景：实验性自身免疫性神经炎(Experimental autoimmune neuritis, EAN)是一种主要由CD4+T细胞介导的、累及外周神经系统(peripheral nervous system, PNS)的急性炎症性脱髓鞘性疾病,是目前公认的研究人类格林-巴利综合征(Guillain-Barre syndrome, GBS)的理想动物模型。通过免疫同种抗原可以在易感动物中成功地诱导EAN的发生他汀类药物是3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶的抑制剂,可以通过甲羟戊酸途径抑制胆固醇的生物合成,在临床上主要用于治疗高胆固醇血症。目前越来越多的研究表明他汀类药物具有免疫调节的作用。而且他汀类药物的免疫调节作用是多效的,如可以抑制T细胞的活化、增殖和迁移等,并且越来越受到人们的关注。研究报道称,在实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis.EAE)中,阿托伐他汀能够促进T细胞反应从促炎的Th1型向抗炎的Th2型转化。近年来研究发现,IL-17在自身免疫性疾病的发展中起着重要的作用。在复发-缓解型多发性硬化的病人中,辛伐他汀能够直接抑制CD4+T细胞中IL-17的分泌。由此可见,在自身免疫性疾病中他汀类药物可以抑制Th1和Th17型细胞的炎症反应。除此以外,他汀类药物还可以抑制抗原递呈细胞(antigen presenting cells, APCs)如树突状细胞和B细胞的成熟和功能。阿托代汀或洛伐他汀能够抑制人类树突状细胞表面共刺激分子如CD40、CD83、CD86和人类白细胞相关抗原-DR(human leukocyte antigen-DR, HLA-DR)的表达,进而降低其诱导T细胞增殖的能力。他汀类药物还可以抑制经IFN-y刺激的人类巨噬细胞和内皮细胞表面主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC)的表达,同时还能降低这些细胞活化T细胞的能力。另外,阿托伐他汀还能够增加人类外周血单个核细胞中CD4+CD25high和CD4+CD25+Foxp3+细胞的数量。综上所述,他汀类药物在动物及人类自身免疫性疾病中有了一定的研究,但到目前为止,还没有关于阿托伐他汀对EAN或人类GBS免疫调节作用的相关报道。基于之前的研究,我们推测阿托伐他汀可以通过免疫调节作用进而改善EAN大鼠的临床症状。因此,我们在EAN大鼠发病的起始阶段开始给予阿托伐他汀治疗,并探讨其对EAN大鼠免疫调节作用的机制。研究目的：探讨阿托伐他汀诱导实验性自身免疫性神经炎免疫耐受的机制。研究方法：1.EAN模型的建立及临床评分采用健康、雌性Lewis大鼠,将BPM溶于H37Ra株热灭活结核杆菌和不完全弗氏佐剂中,双后足垫皮下注射免疫大鼠,每只大鼠用量为200μl。注射当天定为0天,采用双盲法观察,每日称重并观察大鼠的症状进行临床评分,直至免疫后第18天。2.阿托伐他汀治疗EAN大鼠将大鼠随机分为10mg/kg治疗组、1mg/kg治疗组和DMSO对照组。治疗组于免疫后第5天开始每天腹腔注射不同剂量的阿托伐他汀溶液,直至免疫后第18天。对照组给予腹腔注射相同体积的DMSO。3.组织病理学检测处死大鼠后取坐骨神经,100%多聚甲醛固定,石蜡包埋,常规切片,依次经脱蜡、水化、苏木素染色、0,5%伊红液染色、脱水、透明、封片。显微镜下观察坐骨神经中炎性细胞的浸润情况并计数。4.免疫组化检测大鼠坐骨神经石蜡包埋后切片,常规脱蜡、水化,EDTA抗原修复,3%H202阻断内源性过氧化物酶活性,滴加兔抗大鼠IFN-γ抗体和兔抗大鼠IL-17抗体4℃过夜。洗涤后滴加HRP标记的山羊抗兔IgG抗体DAB显色,苏木素复染,脱水,透明,封片。显微镜下观察大鼠坐骨神经中阳性细(?)的情况并计数。5.淋巴结单个核细胞(mononuclear cells, MNC)的制备大鼠麻醉后,无菌条件下取出EAN大鼠腹股沟淋巴结,在无菌滤网上研磨制备成MNC悬液并计数,调整细胞浓度为2×106个细胞/ml。6.淋巴结MNC表面CD80、CD86和MHC-II的流式检测取制备好的MNC悬液,分别加入PE标记的CD80抗体、FITC标记的CD86和MHC-II单克隆抗体,混匀后4℃C条件下孵育30min,洗涤后流式分析测定MNC表面不同分子的表达情况。7.流式检测Treg细胞的情况取制备好的淋巴结MNC悬液,加入FITC标记的CD4抗体和PE标记的CD25抗体4℃C下孵育30min。洗涤后加入固定／破膜工作液(Fixation/Permeabilization)并混匀,4℃C下避光孵育过夜。洗涤细胞后加入PE-Cy5标记的Foxp3抗体40C孵育30min。重悬细胞后上机检测。8. ELISA测细胞培养上清中细胞因子的水平经BPM刺激的淋巴结MNC培养60h后,留取上清。按照ELISA试剂盒说明书进行操作检测细胞因子IFN-γ和IL-17的表达水平。9.统计学分析应用SPSS17.0软件对资料进行统计分析,应用单因素方差分析(one-factor analysis of variance, ANOVA)进行组间比较,P<0.05为差异有统计学意义,结果以均值±标准差(standard deviation, SD)表示。研究结果：1.各组大鼠的发病情况与临床评分与对照组相比,阿托伐他汀10mg/kg和1mg/kg治疗均延迟了EAN大鼠的发病时间,而且明显地改善了高峰期EAN大鼠的临床症状。而且10mg/kg治疗组和对照组EAN大鼠的发病起始时间相比具有明显差异。从免疫后第13天到17天,与DMSO对照组相比,10mg/kg治疗组的大鼠显示了更低的临床评分,1mg/kg治疗组的大鼠也显示了较低的临床评分,但仅在免疫后第16天其临床评分与对照组相比具有统计学差异。2.各组大鼠坐骨神经中炎性细胞浸润的情况与DMSO对照组相比,10mg/kg治疗组和1mg/kg治疗组大鼠坐骨神经中均可见较少的炎性细胞。另外,10mg/kg治疗组与1mg/kg治疗组相比坐骨神经中可见更少的炎性细胞浸润。3.阿托伐他汀抑制了EAN大鼠坐骨神经中IFN-y和IL-17的产生与DMSO对照组相比,10mg/kg治疗组和1mg/kg治疗组大鼠坐骨神经中IFN-y+和IL-17+细胞数量均明显降低了。10mg/kg治疗组和1mg/kg治疗组相比,坐骨神经中IFN-γ+细胞的数量无明显差异。而10mg/kg治疗组大鼠坐骨神经中比1mg/kg治疗组大鼠坐骨神经中可见更少的IL-17+细胞。进一步的分析表明,10mg/kg治疗组和1mg/kg治疗组大鼠坐骨神经中IFN-y+和IL-17+细胞分别占炎性细胞的百分比均明显地低于DMSO对照组,而10mg/kg治疗组和1mg/kg治疗组之间却没有明显差异。4.各组大鼠淋巴结MNC表面CD80、CD86和MHC-Ⅱ分子的表达情况与DMSO对照组相比,10mg/kg治疗组和1mg/kg治疗组均明显的低表达CD80,但10mg/kg治疗组和1mg/kg治疗组之间CD80的表达没有明显差异。另外,CD86和MHC-Ⅱ分子的表达在三组之间没有明显差异。5.各组大鼠淋巴结MNC中Treg细胞的表达情况结果显示,与DMSO对照组相比,10mg/kg治疗组和1mg/kg治疗组均上调了CD4+细胞中CD25+Foxp3+细胞的数量。但是两个治疗组之间却没有明显差异。6.阿托伐他汀对细胞培养上清中细胞因子IFN-γ和IL-17的影响与对照组相比,10mg/kg治疗组和1mg/kg治疗组细胞培养上清中IFN-γ的水平明显的降低了。IL-17的表达在三组之间没有明显差异。结论：1.阿托伐他汀可以诱导EAN的免疫耐受。2.阿托伐他汀诱导EAN免疫耐受的机制主要是通过抑制Thl/Thl7的应答、抑制淋巴结MNC表面共刺激分子的表达及上调Treg细胞的功能来实现的。3.阿托伐他汀对EAN大鼠的保护作用是剂量依赖性的。意义：本研究通过给予EAN大鼠腹腔注射不同剂量的阿托伐他汀溶液,发现阿托伐他汀能够诱导EAN的免疫耐受,且这种作用主要是通过抑制Thl/Thl7的应答、抑制淋巴结MNC表面共刺激分子的表达、上调Treg细胞的功能来实现的。而且阿托伐他汀对EAN大鼠的保护作用是剂量依赖性的。这也为临床上治疗人类GBS提供了一种新的治疗策略和思路。研究背景：重症肌无力(myasthenia gravis, MG)是乙酰胆碱受体(acytylcholine receptor, AChR)抗体介导的、细胞免疫依赖及补体参与的神经-肌肉接头处传递障碍的自身免疫性疾病。病变主要累及神经-肌肉接头突触后膜上的AChR。临床上表现为骨骼肌易疲劳和波动性肌无力。在Lewis大鼠中通过皮下注射从电鳗器官中提取的AChR可以成功地诱导实验性自身免疫性重症肌无力(experimental autoimmune myasthenia gravis, EAMG),它是研究人类MG的机制及治疗方法的可靠动物模型。最近的研究发现,皮下注射大鼠来源的AChR a亚基97-116肽段(R97-116)也可以成功地诱导EAMG。R97-116能够打破抗原的耐受性,并且能够诱导T细胞的自身活化及特异性抗体的产生。R97-116诱导EAMG模型的临床表现、电生理学特征、抗AChR抗体水平和免疫学指标与从电鳗器官中提取的AChR诱导的EAMG模型极为相似。因此,免疫诱导的EAMG模型通常被用来研究抗原特异性免疫应答的机制并探讨治疗MG的新策略。目前临床上治疗MG的方法通常是基于药物的免疫调节作用,需要长期应用,并且具有一定的副作用。因此促使我们探讨一种能够特异性抑制针对AChR免疫应答的新方法。抗AChR抗体可以通过直接结合AChR增加AChR的降解或通过补体介导突触后膜运动终板的损伤造成神经肌肉的传递功能障碍。同时,T细胞依赖的自身抗体反应也可以辅助B细胞产生抗AChR抗体。树突状细胞(dendritic cells. DCs)是一种专用的抗原递呈细胞,既可以通过活化幼稚T细胞起始免疫应答反应又可以诱导免疫耐受的发生。DCs诱导免疫应答或免疫耐受的特征取决于它们的成熟状态：DCs表面上调的共刺激分子如CD83、CD40、CD80、CD86和MHC-Ⅱ分子对于T细胞的活化是必需的。未成熟DCs表面低表达共刺激分子和MHC-Ⅱ分子,推测其具有潜在的诱导免疫耐受或延迟免疫应答的作用。越来越多的证据也表明,未成熟DCs具有诱导耐受性T细胞的能力。在体外,DCs的成熟状态及功能可以通过不同的方法进行调控,如直接负载AChR、与细胞因子共培养、与RelB特异性小干扰RNA共培养等。到目前为止,研究已经发现DCs疫苗可以诱导免疫耐受,并能够对某些自身免疫性疾病如EAMG产生保护作用。腹腔注射经IL-10修饰的脾源DCs能够明显缓解AChR免疫大鼠的临床症状,这种作用与IL-10诱导的耐受性DCs能够调控T细胞及B细胞的应答有关。这就意味着负载有AChR的耐受性DCs可以特异性地作用于AChR特异性T细胞,导致T细胞应答及抗AChR抗体水平的降低。最近的研究表明,RelB沉默的髓源DCs能够抑制EAMG小鼠的症状,这种作用是通过诱导Th17/Thl型细胞反应向Th2型和调节性T细胞反应转化而实现的。这也意味着DCs已经成为治疗免疫系统疾病的重要靶点。他汀类药物是一种3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶的抑制剂,可以通过甲羟戊酸途径抑制胆固醇的合成,进而降低心脑血管疾病的发生率和死亡率。动物实验及临床研究均表明,他汀类药物具有免疫调节的作用。他汀类药物对免疫功能的调节作用主要是通过抑制小GTP结合蛋白的异戊二烯化作用而实现的,很大程度上不依赖于其降脂作用。他汀类药物对免疫系统的调节作用是多效的,包括抑制抗原递呈细胞如DCs和B细胞的成熟和功能。辛伐他汀或阿托伐他汀可以抑制人类DCs的成熟,明显地低表达成熟相关性分子如CD83、CD40、CD86和人类白细胞相关抗原-DR，而且能够明显降低其诱导T细胞增殖的能力。洛伐他汀能够以剂量依赖性的方式抑制小鼠髓源DCs表面MHC-Ⅱ和CD40的表达。我们经过多次体外实验也证实,阿托伐他汀可以抑制EAMG大鼠脾源DCs表面共刺激分子CD80和CD86的表达,说明阿托伐他汀在体外能够成功地诱导耐受性DCs的产生。由此可以推断,他汀类药物可以通过诱导耐受性DCs的产生进而作用于自身免疫性疾病。本课题的研究目的是探讨阿托伐他汀修饰的DCs是否能够诱导EAMG大鼠的免疫耐受。我们用阿托伐他汀在体外与EAMG大鼠脾源在DCs共培养,诱导耐受性DCs的产生再给EAMG大鼠回输到体内。结果显示,阿托他(?)修饰的DCs可以缓解EAMG大鼠的临床症状,其机制主要与上调的调节性T细胞regulatory T cells, Treg cells)数量和Foxp3的表达、抑制的淋巴细胞增殖、下调的IFN-y和IL-17水平、上调的IL-4水平及降低的抗R97-116IgG抗体水平有关。重要的是,这些耐受性DCs主要是在脾脏、胸腺、腹股沟和胭窝淋巴结等免疫器官中通过降低内源性DCs表面CD86和MHC-Ⅱ分子的表达进而发挥其免疫调节作用的。以上数据均表明,阿托伐他汀修饰的DCs为治疗人类MG提供了的一种新的思路和方法。研究目的：探讨体外经阿托伐他汀修饰的DCs诱导实验性自身免疫性重症肌无力大鼠的免疫耐受机制。研究方法：1. EAMG模型的建立及临床评分采用健康、雌性Lewis大鼠,6-8周龄,体重155-175g。取人工合成的大鼠来源的AChRa亚基97-116肽段(R97-116)溶于H37Ra株热灭活结核杆菌和不完全弗氏佐剂中,双后足垫皮下注射免疫大鼠,每只大鼠用量为200μ1。首次接种1周后强化免疫1次。采用双盲法每日或隔日称重并观察大鼠症状。肌力测量采用Lennon临床评分。2.耐受性DCs的制备及鉴定无菌条件下取发病初期EAMG大鼠的脾脏,研磨制备单个核细胞悬液。破红细胞膜后,将细胞液置于培养瓶中培养2h。留取贴壁细胞,加入完全培养液于37℃C、5%C02条件下继续培养。18h后向培养瓶中加入阿托伐他汀溶液(终浓度10μM),对照培养瓶中加入等体积的溶剂DMSO.培养48h后收集悬浮的细胞分别记为他汀修饰的DCs和未经他汀修饰的DCs。通过流式检测不同组DCs表面CD80、CD86、MHC-Ⅱ分子及其胞内IL-10、TGF-β的表达情况。3.动物分组分别设立他汀修饰DCs治疗组、未经他汀修饰DCs治疗组和对照组。于免疫后的第5天和第13天分别给予腹腔注射相应处理的DCs及等体积的RPMI1640培养基,观察症状直至发病高峰期。4.淋巴结单个核细胞(mononuclear cells, MNC)的制备无菌条件下,取发病高峰期EAMG大鼠腹股沟淋巴结,研磨淋巴结,制备MNC悬液并计数,调整细胞浓度为2×106个细胞/ml。5.流式检测Treg细胞取淋巴结MNC,加入FITC标记的CD4抗体和PE标记的CD25抗体4℃C下孵育30min。洗涤后加入固定／破膜工作液(Fixation/Permeabilization)4℃下避光孵育过夜。洗涤后再加入PE-Cy5标记的Foxp3抗体,4℃C孵育30min。适量PBS重悬细胞后上机检测。6.细胞增殖实验将淋巴结MNC种于96孔板内,分别设立R97-116刺激组和1640对照组。培养40h后,留取细胞培养上清,-20℃C保存留做ELISA。再向每孔中加入10μlCCK-8,孵育4h后于450nm波长下测定其光密度值(OD值)。7.细胞周期分析淋巴结MNC种于24孔板内,分别设立R97-116刺激组和1640对照组。培养40h和64h后收集细胞,将细胞液逐滴加入到预冷的70%乙醇中-20℃C过夜。洗涤后加入含RNase A的PI溶液40C避光孵育30min。流式检测并分析细胞周期情况。8. ELISA法检测细胞培养上清中的细胞因子经R97-116刺激的淋巴结MNC培养64h后,留取上清。按照ELISA试剂盒说明书进行操作检测细胞因子IFN-γ、IL-4和IL-17的表达水平。9. ELISA法检测大鼠血清中抗R97-116IgG抗体水平于发病高峰期处死EAMG大鼠,留取心脏血血清,采用ELISA法检测不同组大鼠血清中抗R97-116IgG抗体的水平。10.DCs示踪实验按照说明书分别用红色荧光染料PKH26标记他汀修饰的DCs和未经他汀修饰的DCs,于免疫后第5天将标记好的DCs给EAMG大鼠腹腔注射于体内。分别于注射后的第1天和第3天处死大鼠,留取脾脏、肝脏、胸腺、腹股沟和胭窝淋巴结,做冰冻切片,荧光显微镜下观察外源性经他汀修饰DCs和未经他汀修饰DCs的分布情况并拍照。11.流式检测外源性DCs对内源性DCs的作用给予EAMG大鼠腹腔注射经PKH26标记DCs后的第1天和第3天处死大鼠,留取脾脏制备脾源性DCs。收集不同组的悬浮脾源性DCs,分别加入FITC标记的抗大鼠CD80抗体、FITC标记的抗大鼠CD86抗体和FITC标记的抗大鼠MHC-Ⅱ抗体4℃C避光孵育30min。通过流式把PKH26阴性的内源性DCs和PKH26阳性的外源性DCs区分开来,并分析内、外源性DCs表面不同分子的表达情况。12.统计学分析采用SPSS17.0软件对资料进行统计分析,应用独立样本t检验和单因素方差分析(one-factor analysis of variance, ANOVA)进行组间比较,P<0.05为差异有统计学意义,结果以均值±标准差(standard deviation, SD)表示。研究结果：1.阿托伐他汀在体外能够成功地诱导耐受性DCs经流式检测发现,他汀修饰的DCs较未经他汀修饰的DCs表面明显低表达共刺激分子CD80和CD86。但是胞内细胞因子IL-10和TGF-p的分泌量却没有明显差异。2.他汀诱导的耐受性DCs能够缓解EAMG大鼠的临床症状与未经他汀修饰DCs治疗组和对照组相比,他汀修饰DCs治疗组EAMG大鼠的临床症状明显缓解。未经他汀修饰DCs治疗组和对照组之间无明显差异。与他汀修饰DCs治疗组相比,未经他汀修饰DCs治疗组和对照组大鼠的体重均减轻了,且他汀修饰DCs治疗组和对照组之间从免疫后第29天到第43天均有统计学意义。3.他汀修饰DCs治疗上调了Treg细胞的数量及功能他汀修饰DCs治疗EAMG大鼠后明显地上调了CD4+CD25+T细胞和CD4+Foxp3+T细胞的百分比。但是二者在未经他汀修饰DCs治疗组和对照组之间无明显差异。4.他汀修饰DCs治疗抑制了淋巴细胞增殖反应CCK-8增殖实验显示,未经R97-116抗原刺激时,他汀修饰DCs治疗组、未经他汀修饰DCs治疗组和对照组之间的细胞增殖反应无明显差异。经R97-116抗原刺激后,他汀修饰DCs治疗组的淋巴细胞增殖反应较对照组明显降低。但是他汀修饰DCs治疗组和未经他汀修饰DCs治疗组之间却没有明显差异。刺激指数(stimulation index, SI)分析显示,与未经他汀修饰DCs治疗组和对照组相比,他汀修饰DCs治疗组能够明显抑制R97-116特异性T淋巴细胞的增殖。5.他汀修饰DCs治疗导致了细胞周期的改变流式检测发现,淋巴结MNC与PBS共培养40h和64h后,他汀修饰DCs治疗组细胞周期中S期细胞的比例较对照组均明显降低。然而他汀修饰DCs治疗组和未经他汀修饰DCs治疗组之间却没有明显差异。当与R97-116抗原肽共培养40h和64h后,他汀修饰DCs治疗组细胞周期中S期细胞的比例较对照组和未经他汀修饰DCs治疗组均明显减少,而对照组和未经他汀修饰DCs治疗组之间没有差异。当与R97-116抗原肽共培养40h时,他汀修饰DCs治疗组细胞周期中S期+G2/M期细胞的比例较对照组和未经他汀修饰DCs治疗组均明显减少,对照组和未经他汀修饰DCs治疗组之间也没有明显差异。6.他汀修饰DCs治疗增加了EAMG大鼠淋巴结MNC培养上清中IL-4的水平,同时降低了IFN-y和IL-17的水平。7.他汀修饰DCs治疗降低了EAMG大鼠血清中抗R97-116IgG抗体的水平。8.DCs示踪实验显示,经腹腔注射于EAMG大鼠体内的DCs主要分布于脾脏、胸腺、腹股沟和胭窝淋巴结等免疫器官,而在肝脏中基本上无分布。而且注射后第3天示踪到的DCs数量较第1天明显减少。经PKH26标记的DCs在脾脏中主要分布于红髓,在胸腺中主要分布于皮质,在腹股沟和胭窝淋巴结中分布区域无明显差异。他汀修饰的DCs和未经他汀修饰的DCs分布情况基本一致。9.流式检测外源性DCs对内源性DCs的作用结果显示,在给予腹腔注射经PKH26标记DCs后的第3天,与未经他汀修饰DCs治疗组相比,源自他汀修饰DCs治疗组的外源性和内源性DCs均低表达CD86和MHC-Ⅱ分子。但在给予注射经PKH26标记DCs后的第1天,源自他汀修饰DCs治疗组和未经他汀修饰DCs治疗组的外源性和内源性DCs表面CD80、CD86和MHC-Ⅱ分子均无明显差异。而且在给予注射DCs后的第3天,PKH26阳性的外源性DCs数量明显少于注射后第1天的数量。结论：1.阿托伐他汀在体外能够成功地诱导耐受性DCs的产生。2.阿托伐他汀诱导的耐受性DCs可以成功地诱导EAMG大鼠的免疫耐受。3.阿托伐他汀修饰的脾源性DCs诱导EAMG大鼠免疫耐受的机制主要与上调的Treg细胞数量和功能、抑制的淋巴细胞增殖、Thl/Th17型细胞反应向Th2型细胞反应的转化以及血清中降低的抗R97-116IgG抗体水平密切相关。4.外源性经阿托伐他汀修饰的脾源性DCs在EAMG大鼠体内主要是在脾脏、胸腺、腹股沟和胭窝淋巴结等免疫器官中发挥免疫调节作用的。5.外源性经阿托伐他汀诱导的耐受性DCs在体内主要是通过降低内源性DCs表面CD86和MHC-Ⅱ分子来发挥其免疫调节作用的。意义：本研究在体外通过阿托伐他汀成功地诱导了抗原特异性耐受性DCs的产生,并发现这些耐受性DCs能够诱导EAMG大鼠的免疫耐受,且这种作用主要是通过抑制内源性DCs表面CD86和MHC-Ⅱ分子进而上调Treg细胞、抑制淋巴细胞增殖反应、促进Thl/Th17型细胞反应向Th2型细胞反应转化,最终导致血清中抗R97-116IgG抗体水平的降低而实现的。为临床上治疗人类MG提供了一种新的思路和方法。