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火鸡疱疹病毒(HVT)为一种α疱疹病毒,因其与马立克氏病病毒(MDV)抗原相关性而被广泛用作预防马立克氏病(MD)的活疫苗。本研究的目的首先是构建HVT全基因组感染性细菌人工染色体(BAC)。方法是利用Eco-gpt(黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶)基因和细菌人工染色体(BAC)载体pBeloBAC11的基本功能序列,构建重组病毒转移载体pGAB-gpt-BAC11。通过将pGAB-gpt-BAC11与HVT感染细胞总DNA共转染原代鸡胚成纤维细胞(CEF),待出现病毒噬斑后,利用霉酚酸(MPA)阻断了野生病毒的嘌呤代谢途径,而重组病毒表达黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(XGPRT,gpt),该酶利用外源提供的黄嘌呤完成鸟嘌呤的外源补救合成途径,补救了重组病毒DNA的复制,从而有利于重组病毒的筛选、富集和纯化,经过筛选获得纯化的重组病毒命名为purified-rHVT。提取purified-rHVT感染细胞总DNA电转化大肠杆菌DH10B电转化感受态细胞,在氯霉素抗性平板上筛选阳性克隆,提取质粒DNA,经过凝胶电泳鉴定为大分子DNA的克隆,进一步用酶切和PCR方法对其进行鉴定。随机选取其中的6个BAC克隆,中量提取并纯化BAC DNA磷酸钙法转染次代CEF,以完成HVT重组病毒的拯救。结果,经过6轮霉酚酸-黄嘌呤-次黄嘌呤加压筛选培养基上筛选后,获得纯化的重组病毒,用purified-rHVT感染细胞总DNA电转化DH10B感受态细胞筛选到25个BAC分子克隆化病毒。其中BAC6、BAC8和BAC10转染次代CEF后成功启动病毒感染,产生与野生型HVT感染CEF相似的病毒噬斑形态,说明已经获得拯救出的HVT重组病毒,分别命名为BAC6-derived rHVT、BAC8-derived rHVT和BAC10-derived rHVT。进一步对野生型HVT、purified-rHVT和BAC-derived rHVT体外生长特性进行了比较。结果表明purified-rHVT与野生型HVT在CEF上的增殖曲线相似,但是BAC-derived rHVT在CEF上的增殖曲线与前二者不同,BAC-derived rHVT在CEF上的增殖较慢。本研究构建了HVT全基因组感染性细菌人工染色体,建立了HVT反向遗传操作技术平台。为方便利用现代Red/ET和Cre/loxP重组修饰系统对病毒进行反向遗传操作提供了技术平台,从而为HVT基因功能的研究和HVT活载体基因工程疫苗的开发奠定了基础。另外,对MDV-1型病毒严格的细胞结合特性、致瘤机制和潜伏感染机制的研究也将起到重大促进作用。高致病性禽流感(HPAI)是一种由A型流感病毒引起的禽类高度致死性传染病。血凝素蛋白(HA)是禽流感病毒(AIV)囊膜纤突的一种主要糖蛋白,是流感病毒表面诱导保护性中和抗体的主要抗原。目前国际上构建的流感基因工程疫苗大多是利用HA基因作为目的基因。本研究以HVT BAC为平台,利用Red/ET同源重组技术,通过选择/反选择基因,经过两步法重组:第一步,PCR扩增两侧带有50 bp的左、右同源臂a和b的选择标记基因rpsl-neo表达盒,电转化到含有HVT BAC的大肠杆菌DH10B中,在RecE和RecT酶的作用下,发生同源重组,选择标记基因rpsl-neo替换HVT BAC的US2区;第二步,用带有50 bp左、右同源臂a和b的HA基因表达盒替换选择标记基因rpsl-neo表达盒。在含有氯霉素和链霉素双抗性的平板上筛选阳性克隆,提取BAC DNA,进一步通过PCR扩增HA基因鉴定,鉴定正确的克隆提取并纯化BAC DNA,经过酶切分析,与软件分析结果一致。提取并纯化BAC DNA,使用脂质体包裹转染原代鸡胚成纤维细胞,结果在转染后第4天,出现病毒噬斑,形态大小以及病毒生长曲线与野毒相似,表明拯救出重组病毒,命名为rHVT-HA,进一步经过间接免疫荧光检测表明,重组病毒rHVT-HA在CEF中能正确表达HA基因,具有生物学活性。有望成为一种新型的重组病毒活载体疫苗,实现一次免疫同时预防MD和AI发生的目的,其免疫效果正在通过动物实验进行验证。