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类风湿关节炎（rheumatoid arthritis,RA）是一种病因未明的慢性系统性自身免疫病,其病理特征是手、足小关节的多关节侵蚀性、对称性关节滑膜组织炎症病变。目前治疗RA的药物有很多,其中,甲氨蝶呤（Methotrexate,MTX）作为改善病情抗风湿药（disease-modifying antirheumatic drugs,DMARDs）已被国际上公认的一线治疗药物,但是部分患者大概在服用MTX 6个月会产生对药物敏感性下降的现象,即MTX耐药,MTX耐药可能与多种因素有关,其中由药物转运体介导的MTX外排在肿瘤耐药中已被广泛研究,但在RA耐药中却少见报道。P-糖蛋白（P-glycoprotein,P-gp）是ATP-结合盒（ATP-binding cassette,ABC）超家族中重要成员之一。P-gp是一种外排转运体,它可依赖ATP水解能量将药物泵出胞外,使胞内药物浓度始终维持在较低水平。P-gp在生物体内分布广泛,肝、肾、血脑屏障、小肠、胎盘组织和关节滑膜组织等均存在P-gp及其编码基因多药耐药蛋白（Multidrug resistance,MDR）的MDR1表达,在恶性肿瘤对MTX耐药中发挥着重要的作用。芍药苷-6-氧-苯磺酸酯（Paeoniflorin-6′-O-benzene sulfonate,代号:CP-25）,是一种来源于芍药苷（Paeoniflorin,Pae）结构修饰的新型活性单体。前期课题组研究发现CP-25可明显抑制佐剂性关节炎（Adjuvant arthritis,AA）大鼠炎症反应,对关节炎具有良好的治疗作用。CP-25可以调控大鼠PBMC和Caco-2细胞中P-gp的表达和功能。因此,本研究主要研究CP-25对AA大鼠P-gp的调节作用,同时考察CP-25能否改善P-gp高表达介导的MTX耐药现象。目的:明确CP-25对AA大鼠滑膜细胞P-gp的调节作用,揭示CP-25改善P-gp表达,降低MTX的耐药机制。方法:1)建立大鼠AA模型,随机分为正常组、模型组、CP-25组（50mg/kg/day）、MTX组（0.5mg/kg/3 day）、CP-25（50mg/kg/day）和MTX（0.5mg/kg/3 day）联合用药组,地塞米松组（1mg/kg/day）,通过免疫组化法和Western blot法检测P-gp在大鼠组织中的分布和表达。2)通过TNF-α刺激正常大鼠滑膜细胞,Western blot法检测不同时间、浓度CP-25对TNF-α刺激后正常大鼠滑膜细胞中P-gp表达的影响。3)选用P-gp高表达的肝癌耐药细胞系（Bel7402/5-Fu）,通过MTT法考察肿瘤耐药细胞株对MTX的耐药性及其CP-25逆转耐药株对MTX的耐药情况。同时,Western blot法检测CP-25对Bel7402/5-Fu细胞中P-gp的表达影响。4)收集对数生长期的Bel7402和Bel7402/5-FU细胞用含不同浓度的CP-25及维拉帕米培养,然后再用含罗丹明123的RPMI1640完全培养基培养,流式细胞术检测罗丹明123的蓄积情况;Bel7402和Bel7402/5-FU细胞先用含罗丹明123的RPMI1640完全培养基培养,然后再用含不同浓度的CP-25及维拉帕米培养,用流式细胞术检测罗丹明123的泵出情况。结果:1)CP-25可以明显改善AA大鼠的足爪肿胀数、关节炎指数和足爪肿胀度等整体指标,且CP-25+MTX联合用药组治疗效果好于MTX单独用药;CP-25可以显著缓解关节和脾脏组织的病理改变,CP-25+MTX联合用药组的效果好于MTX单独用药。通过免疫组化法我们发现在大鼠的滑膜、脾脏和小肠组织均有P-gp的表达,且AA大鼠各组织中P-gp的表达相比于正常组明显升高,MTX给药组的组织中P-gp相较于正常组表达也上调,而CP-25可明显下调P-gp的表达,CP-25和MTX联合用药后,各组织中P-gp相比于MTX组表达明显下调。综上所述,CP-25可以明显减轻AA大鼠的关节炎整体指标,可下调AA大鼠组织中P-gp的异常表达,且CP-25+MTX联合用药的效果比MTX单用更明显。2)在给予TNF-α刺激后,正常大鼠滑膜细胞中P-gp的表达上调,其中以20ng/mL的TNF-α刺激12h后,正常大鼠滑膜细胞中P-gp表达最明显。通过不同浓度的CP-25作用不同时间作用于TNF-α刺激的正常大鼠滑膜细胞,各浓度的CP-25作用6h,12h,24h,36h后,各浓度CP-25均能降低TNF-α刺激的正常大鼠滑膜细胞中P-gp的表达,但各浓度的CP-25作用2h后未能显著降低P-gp表达。3)Bel7402和Bel7402/5-FU细胞经MTX作用48h后,MTX对Bel7402细胞的IC50为3.507μg/mL,而对Bel7402/5-FU细胞的IC50为13.054μg/mL,MTX对Bel7402和Bel7402/5-FU细胞的IC50两者相比差异具有显著性,耐药倍数约为4倍。不同浓度CP-25对Bel7402/5-FU细胞无明显直接细胞毒作用,不影响细胞的生长增殖,仅高浓度10-5mol/L表现出抑制作用。逆转浓度的CP-25与不同浓度MTX合用,对MTX抑制Bel7402/5-FU细胞的IC50（5.656μg/mL）具有明显降低作用,细胞耐药水平下降,表示CP-25可以部分逆转MTX的耐药性,其逆转倍数为2.31倍,提示CP-25可以逆转MTX的耐药而增加疗效。通过Western Blotting法发现,相比于Bel7402敏感细胞,Bel7402/5-FU耐药细胞中P-gp表达显著增加,CP-25可以明显下调Bel7402/5-FU细胞中P-gp的表达。流式细胞仪分别检测Bel7402和Bel7402/5-FU细胞对罗丹明123的蓄积和泵出的影响,CP-25可以能显著增加Bel7402/5-FU细胞中罗丹明123的细胞积累量,减少罗丹明123的外排,表明CP-25可以抑制P-gp的外排转运功能。结论:1)CP-25可以下调AA大鼠滑膜、脾脏和小肠组织中P-gp的异常表达,CP-25可以抑制MTX诱导的P-gp的表达;2)TNF-α可刺激正常大鼠滑膜细胞中P-gp的表达上调,CP-25能够降低TNF-α刺激后正常大鼠滑膜细胞中P-gp的表达;3)CP-25可以逆转Bel7402/5-Fu细胞对MTX的耐药性,CP-25可明显下调P-gp在Bel7402/5-Fu细胞中的表达,抑制其外排功能,CP-25可能通过调节P-gp从而逆转MTX的耐药。