一、目的：探讨绝经后骨质疏松小鼠骨髓间充质干细胞成骨分化过程miR-141及BMP信号通路Dlx5/Msx2/Runx2信号轴的作用机制,从微小RNA功能调节角度揭示补肾健脾中药健骨颗粒对BMSCs成骨分化的调控机制,为中医药防治绝经后骨质疏松症提供实验依据。二、方法：1 miR-141调控0P小鼠BMSCs成骨分化机制研究1.1 miR-141内源性表达与绝经后骨质疏松症的相关性研究：采用卵巢切除法建立小鼠绝经后骨质疏松症(PMOP)模型,分为模型组、假手术组。建模成功后,全骨髓法分离培养各组小鼠股骨BMSCs,流式细胞技术对BMSCs进行表型鉴定。通过测定生长曲线、克隆形成情况观察两组细胞形态及生长状态。RT-PCR检测两组miR-141内源性表达情况。1.2 miR-141及成骨基因Dlx5/Msx2/Runx2在BMSCs成骨分化过程中的表达及变化趋势研究：用成骨诱导液对模型组、假手术组BMSCs进行成骨诱导,RT-PCR检测3、8、13d时的miR-141及成骨基因Dlx5、Msx2、Runx2表达,同时行细胞形态观察、碱性磷酸酶(ALP)染色及定量,Western blot验证RT-PCR结果。诱导13d后行茜素红染色,观察钙化结节形成情况。1.3 miR-141调控BMSCs成骨分化过程Dlx5/Msx2/Runx2信号轴的作用机制研究：使用miR-141的促进物miR-141 mimics及miR-141抑制物inhibitor通过Lipo2000转染试剂瞬时转染BMSCs,3d后加入成骨诱导剂进行诱导培养,同时设立NC对照组。细胞培养至8d时,进行细胞形态观察、ALP染色及定量检测；至13d时检测miR-141及Dlx5、 Msx2、 Runx2的表达,并行钙化结节的检测。2健骨颗粒干预0P小鼠BMSCs成骨分化机制研究2.1健骨颗粒含药血清调控miR-141对OP小鼠BMSCs成骨分化机制研究：取模型组BMSCs分成两组行成骨诱导,3d后分别加入健骨颗粒含药血清和生理盐水血清干预(每72小时干预一次),培养至8d时,行细胞形态观察、ALP染色及定量；培养至13d时检测miR-141及Dlx5、Msx2、Runx2的表达,同时行钙化结节检测。2.2在体实验对健骨颗粒影响miR-141调控0P小鼠BMSCs成骨分化的研究：卵巢切除法建立PMOP小鼠模型,分为假手术组10只、卵巢切除小鼠2组各10只,手术1周后,分别用健骨颗粒和生理盐水对两组卵巢切除小鼠灌胃,假手术组用生理盐水灌胃。2月后确定造模成功,取两组卵巢切除小鼠骨组织行microCT骨质疏松指标及三维图像、生物力学检测；并检测骨组织miR-141及Dlx5、Msx2、Runx2表达。三、结果：1造模2月后去卵巢组较假手术组：骨小梁明显减少,稀疏、断裂；骨量下降,骨微结构破碎；胫骨最大载荷明显降低；BMSCs克隆数及细胞增殖能力6天、8天后明显降低；miR-141内源性表达明显偏高。两组BMSCs表型CD29、CD44阳性,CD34、CD45阴性。2成骨诱导后,两组BMSCs组内比较Dlx5、Runx2表达均持续上升,miR-141、Msx2持续下降；ALP逐渐提高,在中期(7天左右)达到高峰后逐渐降低,呈“人”型变化。钙化结节在诱导中期出现,后期达到极值。组间比较去卵巢组BMSCs较假手术组：细胞增殖降低,成骨分化减慢,差异在中期开始明显；miR-141、Msx2表达增高,Dlx5、Runx2表达降低；ALP及钙化结节降低。3网站预测并经双荧光素酶报告基因检测验证了miR-141与Dlx5的3’-UTR序列存在结合位点；细胞转染后检测成骨诱导8天时ALP与13天时钙化结节的形成情况：与对照组相比,mimics组降低而inhibitor组升高,mimics组与inhibitor组差异明显。转染后第13天miR-141inhibitor组Dlx5、Runx2基因和蛋白表达均增加,Msx2表达减少,miR-141mimics组结果相反。4含药血清浓度为10%时,健骨颗粒血清组与生理盐水血清组成骨细胞数量较其它浓度时大,且组间差异最大。中药血清组细胞增殖速度快,成骨分化程度高。中药血清组细胞较空白血清组miR-141表达低,而Dlx5与Runx2表达高,Msx2表达低。5健骨颗粒灌胃组较生理盐水灌胃组小鼠相比：骨量增加,骨小梁数量、宽度、长度、形态和分布部分恢复,密度和联结性增加,但还不能恢复到假手术组水平,皮质骨面积增加,骨髓腔缩小,基本恢复到假手术组水平；小鼠胫骨三点抗压最大载荷明显提高,但略低于假手术组；骨组织miR-141表达降低,而Dlx5与Runx2表达升高,Msx2表达降低。四、结论1卵巢切除法2月即可较好模拟人类绝经后骨质疏松症的骨代谢状态,造模成功。去卵巢可使BMSCs细胞增殖中后期明显降低,细胞形态变差,且使miR-141内源性表达增高,表明miR-141的内源性表达与绝经后骨质疏松症相关联。2在成骨诱导过程中,miR-141、Msx2是成骨负性调节因子,Dlx5、Runx2是正性调节因子；ALP作为成骨代谢合成酶,在随细胞增殖、分化和衰老过程而出现峰值变化。钙化结节作为成骨标志在分化后期含量最高。3 Dlx5是miR-141的靶基因,其关系为转录后抑制；miR-141通过转录抑制作用降低靶基因Dlx5的表达后,使Dlx5下游Runx2表达降低,而Msx2作为Dlx5的同源异形基因,在对Runx2的表达上具有竞争性抑制作用。因此抑制miR-141可级联提高Dlx5/Msx2/Runx2信号轴成骨表达,从而促进成骨。4 10%的健骨颗粒含药血清是促进BMSCs增殖和成骨分化的最佳浓度；健骨颗粒含药血清可抑制去卵巢小鼠BMSCs细胞中成骨负调节因子miR-141的高表达,从而促进成骨细胞分化。5健骨颗粒可抑制去卵巢小鼠骨组织成骨负调节因子miR-141的高表达,并级联提高Dlx5/Msx2/Runx2信号轴成骨表达来促进骨组织成骨作用。健骨颗粒主要从提高骨量和改善骨小梁形态来提高骨强度,从而预防和治疗绝经后骨质疏松症。