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人脑恶性胶质瘤是颅内原发性肿瘤中发病率最高的恶性肿瘤,由于其具有恶性程度高和侵袭能力强的特点,因此临床治愈困难、预后差、病变致死率高。据统计,经过综合治疗后恶性脑胶质瘤患者的存活中位数时间仅为15个月1。目前治疗恶性脑胶质瘤的标准方法主要包括外科切除,放射治疗,化学药物治疗或者这几种治疗方法的联合使用2,这些治疗措施在一定程度上抑制了肿瘤的生长,延长了患者的生命,但是这些方法终究不能彻底消灭肿瘤细胞,并且恶性胶质瘤细胞的恶性程度高,侵袭能力强,即使经过上述综合治疗,往往还是容易复发和转移,造成预后效果不佳。因此寻找一种新的方法辅助治疗恶性胶质瘤,提高治疗预后效果是非常必要的。γ-干扰素自发现以来备受关注,由于其具有多种生物活性,因此受到科学家的青睐,它的生物活性包含抑制肿瘤生长和免疫调节的作用,这些活性作用给肿瘤研究人员寻找抑制肿瘤生长试剂提供了一个理想的选择。经过多年的研究发现γ-干扰素能够直接抑制肿瘤细胞分化并且通过增强机体对肿瘤细胞的免疫应答从而间接抑制肿瘤的进展,目前作为一种辅助制剂被广泛应用于临床治疗癌症患者3、4、5。但是在临床使用过程中发现γ-干扰素的半衰期太短,有实验报道在人体内经静脉注射的γ-干扰素半衰期时间大约为30分钟,经肌肉注射其半衰期时间大约为4.5小时,通过γ-干扰素基因治疗可以维持血浆内γ-干扰素的浓度,但是γ-干扰素受体在体内的广泛表达限制了其特异性治疗作用,造成了抗肿瘤作用的低效性,但是控制γ-干扰素在组织内的分布可以部分解决这一问题6、7。因此重新设计一种γ-干扰素融合蛋白减少其细胞毒性引起的副作用,增强其抑制肿瘤细胞增殖的能力是目前可行的方法。在本实验中,我们在原始γ-干扰素DNA序列的3’端添加一段来自于胎盘生长因子的正电荷多肽以形成新的γ-干扰素融合蛋白DNA序列,该融合蛋白我们称之为合成的γ-干扰素(Synthetic Interferonγ,SIFγ)。为了验证新合成的融合蛋白对恶性胶质瘤细胞增殖的影响,我们将该融合蛋白的表达质粒联合包装质粒和信封质粒共同瞬时转染至293T细胞,收集293T细胞产生的慢病毒,使用慢病毒感染至人脑恶性胶质瘤细胞U87细胞系,然后通过嘌呤霉素筛选出稳定表达新合成的γ-干扰素融合蛋白的U87细胞系,进行肿瘤细胞的各项效应实验,与对照组相比较,从而研究该正电荷多肽片段是否能够增强野生型γ-干扰素抑制恶性胶质瘤细胞增殖的作用,并且检测γ-干扰素下游通路各干扰素调节基因的表达状况,这些研究为新合成的γ-干扰素在肿瘤抑制方面的应用提供了一个有效可行的方向。本实验主要包含以下三个部分。第一部分SIFγ质粒的构建及其在U87细胞系内表达的研究目的:构建SIFγ表达质粒并且研究其在人脑恶性胶质瘤细胞系内稳定表达的可行性。方法:通过RT-PCR方法获得γ-干扰素cDNA和胎盘生长因子内正电荷多肽DNA编码序列,用PCR方法将两者连接起来,通过分子克隆方法将其连接在含有绿色荧光蛋白和嘌呤霉素双选择标记的表达质粒内,扩增后通过酶切鉴定。将验证正确的SIFγ质粒联合包装质粒和信封质粒采用脂质体瞬时转染的方法共转染至293T细胞进行慢病毒包装,收集浓缩产生的SIFγ慢病毒颗粒感染U87细胞,通过内置的双选择标记筛选出稳定表达SIFγ的U87细胞。并且设置相应的对照组,采用相同的方法获得稳定转染相应质粒的U87细胞,为后续实验做准备。结果:成功构建了SIFγ表达质粒,并且筛选出稳定表达SIFγ的U87细胞系。结论:新构建的SIFγ表达质粒能够在U87细胞系内稳定表达,为下一步研究在脑恶性胶质瘤细胞内稳定表达SIFγ对细胞增殖的影响奠定了基础。第二部分SIFγ对U87细胞增殖活性的影响目的:研究SIFγ对U87细胞系增殖活性的影响,并且观察SIFγ联合替莫唑胺治疗恶性脑胶质瘤细胞的效果。方法:通过MTT实验检测细胞增殖活性,平板克隆实验检测细胞克隆形成能力,肿瘤细胞侵袭实验检测肿瘤侵袭性,流式细胞仪检测细胞周期和凋亡。结果:与对照组相比,SIFγ组细胞活性明显降低,克隆形成能力明显减弱,其跨膜侵袭细胞数目明显减少,细胞周期各期无明显改变,细胞凋亡明显增多,并且与替莫唑胺联合培养的SIFγ组对替莫唑胺的敏感性明显增强。结论:与对照组和IFNγ组相比较,胎盘生长因子源性的正电荷多肽能够增强野生型γ-干扰素抑制脑胶质瘤细胞的增殖活性,促进细胞凋亡的生物活性作用,并且能够增强与替莫唑胺联合使用产生的协同作用,进而可以减少替莫唑胺的使用剂量以达到杀死肿瘤细胞的作用,从而减轻其副作用。第三部分SIFγ对γ-干扰素下游信号通路的影响目的:研究SIFγ与野生型IFNγ相比较,对于激活下游JAK/STAT信号转导通路能力的影响。方法:使用双荧光素酶检测试剂盒检测各实验组细胞内IFNγ下游信号通路GAS位点的激活状态,通过RT-PCR方法检测各实验组细胞内IFNγ调节基因CLDN7、ISG15、SERPINB1和STAT1的表达状况,采用Western Blotting方法在蛋白水平检测IFNγ调节基因蛋白的表达情况。结果:与对照组相比,SIFγ组细胞内IFNγ调节基因CLDN7、ISG15、SERPINB1和STAT1在基因水平和蛋白水平上表达均明显增加,并且下游JAK/STAT信号通路激活状态明显增强。结论:新合成的SIFγ融合蛋白激活IFNγ下游信号转导通路即JAS/STAT信号通路的能力明显增强。SIFγ激活JAK/STAT信号通路的机制应该与野生型γ-干扰素相同。