目的糖尿病肾病(Diabetic nephropathy,DN)是糖尿病(Diabetes mellitus,DM)患者最主要的微循环并发症发生于肾脏的表现,主要累及肾小球,导致肾小球滤过率增高,蛋白滤过增加,出现大量蛋白尿,同时也是导致终末期肾病(End stage renal disease,ESRD)的最主要原因。随着DM患病人数的与日俱增,如何防止DN发生及进展越来越获得普遍关注。既往很多实验发现雷公藤多苷(Tripterygium Wilfordii Polyglucosides,TWP)有较强的抗炎和调节免疫作用,其作用特点是多部位,多靶点,既能作用于T细胞、树突状免疫细胞等,又可抑制炎症因子、粘附因子、趋化因子等分泌,从而达到治疗多种自身免疫性疾病的效果。近几年大量基础实验证实,TWP可通过抗炎、免疫抑制作用减轻足细胞和基底膜受损程度,从而降低尿白蛋白排出,缓解肾小球硬化程度,延缓DN的发展过程,但TWP对DM大鼠肾脏纤维化及细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)沉积的作用机理尚不清楚。既往很多研究集中于TGF-β1/Smad信号通路在心脏纤维化、肺纤维化及肾纤维化过程中的作用,但对TGF-β1/NF-κB信号通路对肾纤维化的作用机理尚未明确。因此,本研究以高糖高脂饮食联合尾静脉注射链脲佐菌素(STZ)行造模的DM大鼠为研究对象,采用ELISA方法、q-PCR方法、Western印迹方法及免疫组化方法,旨在研究TWP对TGF-β1/NF-κB信号通路的影响,从而进一步明确TWP对DM大鼠肾组织纤维化的作用。方法清洁级雄性SD大鼠70只,按照随机数字表,随机选取10只作为正常对照组(NC组,n=10)喂养常规饲料。其余60只大鼠高糖、高脂饲料喂养8周后予尾静脉注射链脲佐菌素(Streptozocin,STZ,30mg/kg)建立2型糖尿病(T2DM)模型。将造模成功后的大鼠再随机分为模型对照组(DM)、根据应用TWP剂量的多少进一步分为低(tripterygium glycosides,L-TWP,1mg/kg·d)、中(tripterygium glycosides,M-TWP,3mg/kg·d)、高(tripterygium glycosides,H-TWP,6mg/kg·d)剂量,每组各15只。造模成功后即开始灌胃,NC组和DM组以等量蒸馏水(2ml)灌胃,灌胃8周末处死取材。饲养动物期间按时记录大鼠体重(BW)、血糖、24小时尿微量白蛋白(UMA)变化;处死大鼠阶段记录bw、肾重(kw);留取血标本检测血糖、肝肾功能、血脂及血常规;采用elisa法检测大鼠血清中tgf-β1、nf-κbp65、iv型胶原(collageniv,col-iv)、纤连蛋白(fibronection,fn)、层粘连蛋白(laminin,ln);留取肾组织标本,光镜下观察大鼠肾组织肾小球病理改变;采用q-pcr法、western印迹法分别从基因水平、蛋白水平检测大鼠肾组织中tgf-β1、nf-κbp65、col-iv、fn、ln水平,采用免疫组化法检测上述各因子蛋白表达的肾组织定位情况。结果1.与nc组相比,高糖高脂饲料喂养8周后,大鼠血甘油三酯(tg)、总胆固醇(tc)、空腹胰岛素(fins)、胰岛素抵抗指数(homa-ir)和胰岛β细胞功能指数(homa-β)高于nc组(p<0.05);stz注射后大鼠较nc组大鼠体重降低,同时伴有多饮、多尿、多食等症状表明t2dm大鼠造模成功。2.一般指标:(1)体重、血糖:与nc组相比,dm组大鼠造模后血糖显著上升(p<0.05),体重显著减轻(p<0.05);(2)肾重指数(kw/bw):与nc相比,dm组大鼠kw/bw明显升高(p<0.05),twp治疗组中,kw/bw均有所下降(p<0.05),以h-twp组下降最为显著(p<0.05);(3)血脂:与nc组相比,dm组大鼠tg、tc水平显著升高(p<0.05),twp治疗组未见显著改变(p>0.05);(4)肝、肾功能、血常规:大鼠肝、肾功能和血常规在各组间均无明显差异(p>0.05)。3.24h尿微量白蛋白(24huma):(1)与nc组相比,dm组大鼠uma水平显著升高(p<0.05);与dm组相比,twp治疗组大鼠uma水平显著降低(p<0.05),且呈剂量依赖性。4.各组大鼠肾小球病理形态学变化:nc组肾组织结构正常;dm组he染色可见肾组织内大片炎性细胞浸润,masson染色可见肾组织出现明显纤维化,pas染色可见肾小球基底膜增厚。经不同剂量twp干预后,上述病理改变明显减轻,且呈剂量依赖性改善。5.采用elisa法检测大鼠血清中tgf-β1、nf-κbp65、col-iv、fn、ln水平:(1)与nc组相比,dm组血清tgf-β1、nf-κbp65、col-iv、fn、ln含量明显增多(p<0.05);与dm组相比,twp治疗组血清tgf-β1、nf-κbp65、col-iv、fn、ln含量显著下降(p<0.05),且呈剂量依赖性下降。6.应用q-pcr法检测大鼠肾组织中tgf-β1、nf-κbp65、col-iv、fn、lnmrna的表达:(1)与nc组相比,dm组肾组织中tgf-β1、nf-κbp65、COL-IV、FN、LN mRNA表达水平显著增多(P<0.05);与DM组相比,TWP治疗组肾组织中TGF-β1、NF-κB p65、COL-IV、FN、LN表达水平显著降低(P<0.05),且呈剂量依赖性降低。7.应用Western印迹法检测大鼠肾组织中TGF-β1、NF-κB p65、COL-IV、FN、LN蛋白的表达:(1)与NC组相比,DM组肾组织中TGF-β1、NF-κB p65、COL-IV、FN、LN蛋白表达显著增多(P<0.05);与DM组相比,TWP治疗组肾组织中TGF-β1、NF-κB p65、COL-IV、FN、LN蛋白表达显著下降(P<0.05),且呈剂量依赖性下降。8.应用免疫组化法检测大鼠肾组织中TGF-β1、NF-κB p65、COL-IV、FN、LN蛋白的表达:与NC组相比,DM组肾小球内可见标记的TGF-β1、NF-κB p65、COL-IV、FN、LN细胞浸润(P<0.05);TWP组可见肾组织中TGF-β1、NF-κB p65、COL-IV、FN、LN表达明显降低(P<0.05),M-TWP组、H-TWP组较L-TWP组下降更加明显(P<0.05)。结论1.TGF-β1介导肾脏纤维化发生、发展过程,NF-κB炎性反应信号通路所起的作用不容忽视。TWP干预组较DM组大鼠KW/BW、24h UMA及病理改变均有所改善,且呈剂量依懒性。2.雷公藤多苷具有独特抗炎、免疫抑制作用,可抑制系膜细胞的增生,改善肾小球基底膜电荷状态抑制蛋白排出,减轻肾小球纤维化。3.TGF-β1及其活化的NF-κB炎性反应信号通路共同介导ECM的合成,而且其又协同促进IV型胶原(COL-IV)、纤连蛋白(FN)及层粘连蛋白(LN)合成,共同介导糖尿病肾病的发生、发展过程。4.TWP通过抑制TGF-β1/NF-κB信号通路,改善DM肾组织纤维化病变,且呈剂量依赖性改善。