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背景氧化应激是许多急性或慢性肺部疾病的主要发病机制之一，严重危害了人类的健康。谷胱甘肽（glutathione，GSH）是人体内重要的保护性抗氧化物质。γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）是体内合成GSH的限速酶，其由催化亚单位(GCLC)和调节亚单位(GCLM)组成。GCLC含有γ-GCS所有底物的结合位点和所有的催化亚基，故具有γ-GCS所有的催化活性。因此，GCLC基因表达水平将很大程度影响体内GSH的含量。本课题组前期的研究通过转录因子分析软件分析发现，人GCLC基因上游-790~-766区域内有AP-2转录调控元件与NF-κB转录调控元件。本实验将对AP-2（-784~-770）结合元件及NF-κB（-790~-785）结合元件的转录调控进行进一步的研究，有助于在分子生物学水平了解GSH的变化机制。目的分析人GCLC基因上游-790~-766区域内AP-2（-784~-770）元件及NF-κB（-790~-785）元件的作用，探索其可能的转录调控机制。从而部分阐明GSH水平变化的机制，为在分子生物水平阐明肺疾病发病机制提供一定的理论基础。方法1设计四种含突变AP-2元件（-784~-770）的基因片段（-790~-766），并人工合成对应的突变探针。采用电泳迁移率分析(EMSA)实验观察突变探针是否能与核蛋白特异性结合，并用超级迁移率实验（Supershiftassay）检测突变探针是否能与转录因子AP-2和NF-κB的抗体结合。2运用重叠PCR技术对AP-2元件（-784~-770）进行定点突变。并构建能表达虫荧光素酶报告基因的突变型质粒。3将野生型质粒、突变型质粒分别与内参照质粒pRL-TK共转染16HBE细胞，检测转染后虫荧光素酶活性值，以判断突变AP-2元件对人GCLC基因转录活性的影响。结果1经过EMSA及Supershift试验筛选出其中一种含突变AP-2元件（-784~-770）的基因片段（-790~-766）能与16HBE细胞核蛋白结合，但不能与转录因子AP-2抗体结合。2经测序鉴定，突变AP-2载体符合预期设计，成功构建。3将成功构建的突变AP-2质粒与内参照质粒pRL-TK共转染16HBE细胞后检测虫荧光素酶活性值，结果发现突变AP-2（-784~-770）质粒较野生型质粒的荧光素酶活性明显下降(P＜0.01)，说明人GCLC基因转录调控区域AP-2元件（-784~-770）具有正性转录调控功能。结论1人GCLC基因转录起始位点上游-790~-766bp区间内有转录因子AP-2及NF-κB的转录结合位点。2人GCLC基因转录起始位点上游的AP-2结合元件（-784~-770）具有正性转录调控功能。