【摘 要】
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伪狂犬病毒（Pseudorabies Virus,PRV）属于疱疹病毒科疱疹病毒属,该病毒的天然宿主是猪,可引起母猪发生流产、产出死胎,并伴有呼吸障碍。自2011年以来,Ⅱ型PRV在我国出现并流行,给我国养猪业造成巨大经济损失。猪圆环病毒3型（Porcine circovirus type 3,PCV3）是2015年新出现的一种猪病毒性传染病病原,能够产生猪生殖障碍、心脏和多系统炎症等临床症状,其
【基金项目】
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浙江省重点研发计划项目（2020C02011）；
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伪狂犬病毒（Pseudorabies Virus,PRV）属于疱疹病毒科疱疹病毒属,该病毒的天然宿主是猪,可引起母猪发生流产、产出死胎,并伴有呼吸障碍。自2011年以来,Ⅱ型PRV在我国出现并流行,给我国养猪业造成巨大经济损失。猪圆环病毒3型（Porcine circovirus type 3,PCV3）是2015年新出现的一种猪病毒性传染病病原,能够产生猪生殖障碍、心脏和多系统炎症等临床症状,其衣壳（Capsid,Cap）蛋白是唯一的结构蛋白,能刺激动物机体产生针对PCV3的血清抗体,也是研制基因工程疫苗理想的抗原蛋白。迄今为止,PRV和PCV3共感染情况在兽医临床上屡见不鲜,所以研制预防PRV和PCV3双重感染的重组病毒疫苗工作显得尤为迫切。本研究以II型PRVHD/c株为亲本株,选择非结构蛋白基因gC和gG作为靶标位点,设计特异性引物扩增针对两个基因缺失的同源重组臂片段,同时构建了表达GFP的荧光表达盒和带有CMV启动子的PCV3 Cap表达盒。采用经典的分子生物学方法将各片段依次连接到pUC18载体上,构建了针对两个位点的同源重组转移载体并进行了测序验证,并且验证了两个载体质粒能够在细胞水平上稳定表达PCV3 Cap蛋白,为后续构建表达PCV3 Cap的PRV重组病毒提供重要分子工具。同时,本研究以Ⅱ型PRV HD/c基因组为模板,扩增出囊膜蛋白gC和gG基因截短序列,并通过构建到pET-28a（+）载体上进行原核表达gC和gG的主要抗原表位区域。以变性纯化的重组His-gC和His-gG蛋白为免疫原分别免疫BALB/c小鼠和新西兰白兔,从而获得了 WB和IFA反应性良好的多克隆抗体。同时取免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞进行细胞融合,随后采用有限稀释法进行4次亚克隆筛选,分别获得了 3株稳定分泌gC和gG单克隆抗体的杂交瘤细胞株。通过WB和IFA检测可知,所制备的两种单克隆抗体分别与外源转染样品和PRV感染样品均有良好反应,并进行了抗原表位的初步鉴定。通过使用针对gC的单克隆抗体可用于临床检测PRV疫苗毒株与流行毒株,并且PRV gC和gG单克隆抗体的制备也为研究其生物学功能以及基因缺失疫苗株的鉴定提供了基本工具。
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