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目的：建立一种初步富集肝癌干细胞相关亚群的方法,对其生物学特性进行分析,寻找肝癌干细胞特异性标志分子,为研究肝癌干细胞的本质提供实验依据。方法：1.应用流式细胞术检测人肝癌细胞系Hep3B、HepG2(?)SK-Hep-1中的SP细胞,确定肿瘤干细胞的存在；无血清悬浮培养法分离培养肝癌SK-Hep-1细胞中的肝癌干/祖样细胞(球形体细胞)。2.应用MTS和流式细胞术观察球形体细胞增殖和周期分布情况；应用免疫印迹法检测球形体细胞细胞周期调控蛋白的表达水平。3.软琼脂克隆形成实验观察球形体细胞的自我更新、无限增殖能力；将球形体细胞置于含血清培养基中诱导分化,观察其分化能力。4.应用MTS和流式细胞术检测球形体细胞对化疗药物的敏感性和抗DDP诱导凋亡的能力；应用实时荧光定量PCR和流式细胞术检测球形体细胞耐药基因ABCG2、MDR1和MRP1mRNA和蛋白的表达水平,观察其耐药性。5.应用实时荧光定量PCR(?)TRAP-PCR银染法检测球形体细胞的端粒酶活性：应用实时荧光定量PCR和免疫印迹法观察球形体细胞干细胞基因Oct4、Nanog、BMI-1、Notch1、B-catenin以及SMO mRNA和蛋白的表达水平。6. NOD/SCID小鼠体内成瘤实验观察球形体细胞的体内成瘤能力。7.应用MTS和Transwell小室实验模型检测球形体细胞的体外粘附和侵袭能力,观察其转移性。8.应用免疫组化的方法观察球形体细胞细胞角蛋白CK7、CK19、CK8和CK18的表达水平9.应用流式细胞术观察干细胞表面标志分子(CD133、CD117、CD90、CD34、CD44(?)EpCAM)在球形体细胞中的表达;应用免疫印迹和免疫组化方法观察CD117在SK-Hep-1细胞和球形体细胞中的表达差异；应用流式细胞术观蔡球形体细胞分化过程中CD117的表达情况。结果：1.人肝癌细胞系SK-Hep-1中的SP细胞比例为1.2%,另外两株人肝癌细胞系HepG2和Hep3B均未检测到SP细胞；SK-Hep-1细胞可在添加生长因子的无血清培养基中呈球形悬浮生长并可长期培养、扩增。2.球形体细胞呈低增殖状态,大多数处于静止期,即细胞周期G0/G1期；免疫印迹结果显示,球形体细胞中抑制细胞周期进程的蛋白p21和1p27表达明显增高,而促进细胞周期进程的蛋白cyclinD表达明显下降。3.球形体细胞具有更强的克隆形成能力,在双层软琼脂培养基中可呈克隆样生长,克隆形成率为51.63%,显著高于SK-Hep-1细胞的克隆形成率17.54%；球形体细胞在含血清的培养基中呈现与SK-Hep-1细胞相同的贴壁生长方式,细胞形态上与SK-Hep-1细胞无差别。4.药物敏感性分析结果显示,不同剂量的化疗药物作用48hrs,随着药物浓度的增大,球形体细胞和SK-Hep-1细胞的细胞活性均逐渐减小,但球形体细胞的细胞活性均明显高于SK-Hep-1细胞：同时球形体细胞在20μg/mlDDP作用48小时后凋亡率为22.92%,而SK-Hep-1细胞的凋亡率为63.55%,提示球形体细胞抗凋亡的能力明显高于SK-Hep-1细胞；球形体细胞耐药基因ABCG2、 MDR1和MRP1mRNA和蛋白表达水平明显高于SK-Hep-1细胞。5.球形体细胞hTERT mRNA的表达水平明显高于SK-Hep-1细胞,具有较强的端粒酶活性；此外,球形体细胞中干细胞基因Oct4、Nanog、BMI-1、Notch1、和SMO mRNA和蛋白的表达水平明显高于SK-Hep-1细胞,而β-catenin的mRNA水平虽然高于SK-Hep-1细胞,但其蛋白表达水平无明显变化。6.体内成瘤实验结果显示球形体细胞具有较强的致瘤能力,1000个球形体细胞接种于NOD/SCID小鼠皮下即可形成肿瘤,接种7000个球形体细胞成瘤率即可达到100%,并能分化出与原代细胞特征相仿的肿瘤细胞；而低于10000个SK-Hep-1细胞均不能形成肿瘤。7.球形体细胞的体外粘附和侵袭能力明显高于SK-Hep-1细胞,提示球形体细胞具有高转移性。8.细胞角蛋白免疫组化结果显示,CK8、CK18呈强阳性/CK7、CK19呈阴性表达的球形体细胞经血清诱导分化后生成CK8、CK18呈强阳性/CK7、CK19阳性表达的肿瘤细胞,与SK-Hep-1细胞的表型基本相同。9.干细胞表面标志分子检测结果显示,SK-Hep-1细胞CD117表达率约为95%,而球形体细胞表达率仅为1%左右,变化最为显著,免疫印迹和免疫组化结果与流式细胞术检测结果一致,并且随着分化后球形体细胞培养代数的增加,CD117的表达逐渐增高。而其他标记分子在两种细胞中的表达无明显差别。结论：人肝癌SK-Hep-1细胞存在异质性,其中极小部分细胞可在无血清培养基中持续增殖并呈球形悬浮生长,具有自我更新、无限增殖和分化潜能,高表达干细胞基因,具有高耐药性等于细胞特性；同时实验证明也具有较强的致瘤能力和高转移性等肿瘤细胞的特点。体内体外实验结果均证实从SK-Hep-1细胞中分离的球形体细胞具有肿瘤干细胞样特性,因此,我们认为球形体细胞是富含肝癌干细胞的细胞群,或称为肝癌干/祖样细胞,其表面标志CK7-CK19-CD117-,是否可以作为肝癌干细胞筛选标志有待于今后进一步研究。