小鼠成骨细胞受X线辐照后培养上清液的蛋白芯片分析

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研究背景与目的放射治疗是口腔颂面-头颈肿瘤的重要治疗手段,其在杀灭肿瘤的同时也损伤正常组织,可导致骨代谢紊乱、骨质疏松症、骨愈合不良等,而放射性领骨坏死是严重并发症之一,其发病机制尚未明确。电离辐射等物理刺激可引起骨的改建,成骨细胞的骨形成与破骨细胞的骨吸收共同维持着骨的动态平衡。细胞受到电离辐射后会发生形态、表型、基因和蛋白表达的变化,那么辐照是如何影响成骨细胞增殖、分化及成骨相关基因表达,以及成骨细胞受到不同剂量辐照后所分泌的蛋白是否存在差异,是否存在辐射损伤特异性蛋白,这些差异蛋白涉及哪些生物学过程及信号转导通路,目前尚缺乏实验进一步研究证实。因此,为了填补这一关键的知识空白,本研究中通过观察不同剂量辐照对成骨细胞增殖分化及其分泌蛋白的影响,筛选辐射损伤可能的特异性蛋白并初步探讨可能涉及的生物学过程及信号转导通路,为更好地理解辐射对骨组织的生物学作用提供参考。方法1.取体外培养的小鼠成骨细胞MC3T3-E1,按辐照剂量分成0 Gy组、2 Gy组、4 Gy组、8 Gy组、16 Gy组5组,使用6 MV直线加速器分别予以X线辐照,观察辐照后细胞形态的改变,CCK8法检测细胞增殖情况,辐照后7 d检测0 Gy组、2 Gy组、4 Gy组、8 Gy组细胞内ALP活性及采用qPCR检测细胞OPG、OCN、Runx2、ALP的mRNA表达水平。2.小鼠成骨细胞辐照后7 d分别收集0 Gy组、2 Gy组、4 Gy组、8 Gy组细胞上清液,采用高通量蛋白芯片技术检测分泌蛋白的表达情况,GO和KEGG pathway分析差异蛋白的生物学信息,并筛选出辐射剂量依赖性上调的差异蛋白,通过ELISA验证。结果1.辐照后成骨细胞胞体肿大,细胞核变大,胞浆内空泡增多,特别是核区附近出现黑色颗粒,贴壁能力减退,出现较多漂浮的细胞,随着辐射剂量增加,上述改变愈加明显。采用CCK8法检测细胞增殖情况,辐照后3 d、5 d和7 d,4个辐照组均导致成骨细胞增殖呈辐射剂量依赖性降低(P<0.05)。辐照后7 d,各辐照组细胞内ALP活性均较对照组低,差异有统计学意义(P<0.05)。2 Gy辐照未显著引起成骨相关基因mRNA表达水平的变化;4 Gy以上辐照组较对照组OPG、Runx2和ALP基因的表达下调,差异有统计学意义(P<0.05);而OCN基因的表达水平在4 Gy辐照时下调,8 Gy辐照时显著上调(P<0.05)。2.成骨细胞辐照后上清液中共发现36个表达差异蛋白,GO及KEGG Pathway分析表明X线辐照成骨细胞后,多种炎症细胞及免疫细胞被激活,细胞增殖、分化、迁移、趋化能力增强,细胞因子-细胞因子受体相互作用、细胞黏附信号、血管生成信号、TNF信号通路、JAK/STAT信号通路、ERK1和ERK2信号通路、IL-17信号通路等明显富集。其中IL-22和TremL1的表达水平在3个辐射剂量下都存在差异,并且均表现为上调。RANTES呈辐射剂量依赖性表达上调,ELISA验证成骨细胞辐照后RANTES表达水平显著上调(P<0.05)。结论1.X线辐照抑制成骨细胞的增殖、分化和基质矿化能力,从而干扰骨形成。2.成骨细胞受到X线辐照后表达的蛋白质涉及急性炎症、免疫反应、氧化应激、防御反应,伴有组织修复等相关生物过程及信号通路。3.RANTES可能是成骨细胞受辐射损伤后引发炎症、趋化、修复等一系列生物过程的关键因子,但其具体作用机制仍待进一步研究。
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