论文部分内容阅读
背景:结直肠癌是全球最常见的癌症之一,它的发生和进展可因累积抑癌基因和癌基因的突变而形成。DNA损伤修复系统缺陷导致基因突变率增高,促进肿瘤的发生和进展。作为一种重要的DNA修复酶,Nei核酸内切酶Ⅷ样蛋白1（Nei endounucleaseⅧ-like1,NEIL1）与多种癌症的发生有关,但是其对结直肠癌进展的确切作用尚不清楚。通过大数据分析我们发现高表达NEIL1的结直肠癌患者存活较差。在人结肠癌细胞中通过siRNA沉默和重组质粒过表达实验,我们发现NEIL1可以抑制结肠癌细胞凋亡和促进细胞活力。通过大数据及靶向软件分析我们发现NEIL1可能受到miR-7-5p的潜在靶向调控,并对其进行了验证。并探讨了miR-7-5p的调控对NEIL1抑制细胞凋亡和促进细胞活力作用的影响。我们的数据表明NEIL1通过抑制人结肠癌细胞的凋亡而促进细胞活力,此作用受miR-7-5p负向调控调节。本研究为NEIL1调控结肠癌发展的网络提供了新颖的见解,并为其作为结直肠癌的潜在治疗靶点提供依据。目的:本研究旨在探讨内切核酸酶VIII-like1（NEIL1）在结直肠癌（CRC）发病机理中的作用。方法:[1]设计并合成siNEIL1,将其及对照siNC转染入人结肠癌细胞HCT116和SW480中,qRT-PCR和Western blotting检测转染效率。MTT法检测结肠癌细胞活力的改变;PI染色流式细胞仪检测细胞凋亡的改变;Western Blotting检测凋亡相关蛋白的变化。另外,构建NEIL1过表达质粒,将其及对照质粒转染入人结肠癌细胞中,观察上述变化。[2]生物信息学软件分析miR-7与NEIL1表达量的相关性和靶向性。构建miR-7表达质粒,及设计并合成miR-7-5p的抑制剂,运用上述方法观察人结肠癌细胞活力和细胞凋亡的变化。[3]改变miR-7水平,观察NEIL1对人结肠癌细胞活力和凋亡变化的影响。结果:[8]从TCGA数据库中提取结直肠癌组织中NEIL1表达的数据,使用长秩分析发现NEIL1高表达的CRC患者存活较差。实时定量PCR和Western blotting结果显示细胞中NEIL1的mRNA和蛋白质表达均明显下调。细胞活力MTT分析显示,与对照组相比,NEIL1表达的下调导致细胞活力明显下降。流式细胞仪检测细胞凋亡发现,NEIL1表达下调的细胞中早凋和晚凋细胞均增多。另外,Western blotting结果显示转染siNEIL1使人结肠癌细胞中Bax增多、Bcl-2减少,Bax/Bcl-2的平衡偏向促凋亡,而且被切割活化的Caspase-9的含量亦升高。[9]将重组高表达NEIL1的质粒和对照质粒分别转染入HCT116和SW480细胞中,实时定量PCR和Western blotting结果显示细胞中NEIL1的mRNA和蛋白质表达明显上调。MTT分析显示,与对照组相比,高表达NEIL1促进了细胞活力。流式细胞仪检测细胞凋亡发现,高表达NEIL1使细胞中凋亡细胞减少,而且高表达NEIL1使人结肠癌细胞中Bax/Bcl-2的平衡偏向抗凋亡,被切割活化的Caspase-9的含量下降。这些均与NEIL1表达下调所得到的结果相反。[10]微小RNA可以通过结合靶基因的3’-UTR而转录后负性调节靶基因的表达。我们通过两个常用公共数据库TargetScan（http://www.targetscan.org/vert71）和miRDB（http://mirdb.org/miRDB）,并使用在线交叉检查工具（http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）找到miR-7-5p可以靶向NEIL1的3’-UTR。并且在结肠癌组织和人结肠癌细胞中发现,miR-7-5p和NEIL1的表达量呈现负相关。因此我们构建了重组高表达miR-7的质粒,并设计合成了miR-7-5p的抑制剂。将miR-7高表达质粒和对照质粒分别转染入HCT116和SW480细胞中,实时定量PCR结果无明显变化;将miR-7-5p抑制剂miR-7-5p-inhibitor和inhibitor-NC对照分别转染入HCT116和SW480细胞中,实时定量PCR结果显示细胞中miR-7-5p有下调。重要的是,实时定量PCR和Western blotting结果亦显示,与对照组相比,高表达miR-7使HCT116和SW480细胞中NEIL1的mRNA和蛋白质表达明显下降,而转染miR-7-5p-inhibitor使HCT116和SW480细胞中NEIL1的mRNA和蛋白质表达出现上调。[11]miR-7-5p在人结肠癌细胞中的作用,MTT分析显示,与对照组相比,高表达miR-7使HCT116和SW480细胞活力明显下降。流式细胞仪检测细胞凋亡发现,高表达miR-7使细胞中早凋和晚凋的细胞均增多,而且使细胞中Bax/Bcl-2的平衡偏向促凋亡,被切割活化的Caspase-9的含量升高,提示在人结肠癌细胞中升高miR-7的表达可以促进细胞凋亡和降低细胞活力,这与转染siNEIL1的实验结果一致。与之相反,与对照组相比,转染miR-7-5p-inhibitor促进HCT116和SW480的细胞活力,减少凋亡细胞,细胞中Bax/Bcl-2的平衡偏向抗凋亡,被切割活化的Caspase-9的含量下降,与高表达NEIL1所得结果一致。[12]以上结果说明在人结肠癌细胞中miR-7-5p可以促进细胞凋亡,抑制人结肠癌细胞的活力,与NEIL1的作用恰好相反,提示miR-7-5p在人结肠癌细胞中可以负性调控NEIL1,而对细胞凋亡、细胞活力产生影响。接着,我们在HCT116和SW480细胞中分别或同时过表达NEIL1和miR-7,发现过表达miR-7明显减少NEIL1提高的人结肠癌细胞活力和凋亡抑制程度。这些结果进一步说明在人结肠癌细胞中,miR-7的表达改变可以负向调控NEIL1,从而导致细胞凋亡及细胞活力发生改变。结论:[3]在人结肠癌细胞中降低NEIL1的表达可以促进细胞凋亡和降低细胞活力。[4]在人结肠癌细胞中NEIL1可以抑制细胞凋亡,提高细胞活力,从而导致NEIL1高表达的CRC患者存活较差。[5]NEIL1促进CRC细胞的增殖,其受miR-7-5p负调控。以上结果说明在人结肠癌细胞中miR-7-5p可以促进细胞凋亡,抑制人结肠癌细胞的活力,与NEIL1的作用恰好相反,提示miR-7-5p在人结肠癌细胞中可以负性调控NEIL1,而对细胞凋亡、细胞活力产生影响。