慢性肾小球肾炎是我国终末期肾脏病的主要原发病,蛋白尿是慢性肾小球肾炎的主要临床表现和疾病进展的核心标志之一。足细胞肌动蛋白骨架重排可致足细胞活动性增加、足突融合,损伤足细胞,是导致蛋白尿发生的重要机制。中医药在减少蛋白尿、延缓肾功能进展等方面具有良好的临床疗效。本课题组在知名肾病专家戴希文教授多年临床经验的基础上,总结出治疗慢性肾炎的经验方益气清热膏,临床疗效显著,但其作用机制尚不明确。基于前期研究,本研究旨在阐述益气清热膏是否可通过影响足细胞肌动蛋白骨架重排,减轻足细胞损伤,从而降低蛋白尿,并探讨其作用机制。本次研究从体内实验和体外实验两个方面着手:(1)体内研究通过建立嘌呤霉素氨基核苷肾病大鼠模型,观察益气清热膏对足细胞损伤以及对足细胞骨架调控相关蛋白的影响。(2)体外研究通过离体培养条件永生性小鼠足细胞系,观察益气清热膏对PAN损伤致足细胞骨架重排的影响;检测RhoA/ROCK信号通路关键分子的表达情况及其下游重要靶点的磷酸化水平,进一步探讨益气清热膏对RhoA/ROCK信号通路的影响。实验一益气清热膏减轻嘌呤霉素氨基核苷肾病大鼠足细胞损伤的机制研究目的:观察益气清热膏对嘌呤霉素氨基核苷肾病大鼠的干预作用,从肌动蛋白骨架相关蛋白的表达探讨其作用机制。方法:40只雄性Wistar大鼠随机分为假手术组、模型组、益气清热膏组和环孢素组。通过单次颈内静脉注射PAN(40mg/kg体质量)建立大量蛋白尿模型。造模后分组给药,益气清热膏组按4 g/kg体重灌胃,环孢素组按21mg/kg体重灌胃,假手术组和模型组给予等体积蒸馏水。分别于造模前1天和造模后的第5、10天测定24h尿蛋白定量;于造模后第11天取材,测定血清生化指标。通过光镜和透射电镜观察肾脏病理改变和超微结构变化。采用RT-PCR和Western Blot法检测肌动蛋白细胞骨架调控蛋白(α-actinin-4、Synaptopodin、Desmin、Nestin、Vimentin 和 uPAR)mRNA 和蛋白的定量表达。采用 ELISA法检测肾组织中Rho相关GTP结合蛋白酶的表达情况。结果:(1)理化指标:造模后第5天,与假手术组相比,其余各组大鼠的尿蛋白定量均明显升高(P<0.01);与模型组相比,益气清热膏组和环孢素组均可显著降低PAN大鼠模型的尿蛋白定量(P<0.05),两治疗组之间差异无明显统计学意义(P>0.05)。造模后第10天,益气清热膏组和环孢素组的大鼠尿蛋白定量均显著低于模型组(P<0.05)。模型组大鼠的BUN、SCr、TC、TG、LDL水平明显高于假手术组,其ALB水平明显低于假手术组(P<0.05)。益气清热膏组可显著降低BUN、SCr、TG水平,升高ALB水平(P<0.05),且益气清热膏的效果优于环孢素(P<0.05)。(2)肾脏病理结果:光镜显示模型组系膜细胞数轻度增多,系膜基质增生,部分球囊粘连;肾小管上皮细胞轻度空泡变性,肾间质可见少量炎性细胞浸润。益气清热膏组系膜细胞和基质增生不明显,肾小管上皮细胞轻度空泡变性,肾间质未见炎性细胞浸润。透射电镜显示,模型组足突广泛融合,足突宽度(Foot Process Width,FPW)明显增加(P<0.05),裂孔间隙消失,内皮窗孔凌乱,足细胞内线粒体肿胀,系膜增生,基底膜区增厚不明显。与模型组相比,益气清热膏组足突融合现象明显好转,足突宽度显著降低(P<0.05),部分足突恢复正常,柱状足突排列于基底膜侧。(3)RT-PCR结果:与假手术组相比,模型组α-actinin-4、Synaptopodin、Nestin、Desmin、Vimentin 和 uPAR 的 mRNA 水平显著增高(P<0.01)。与模型组相比,益气清热膏组可明显下调肾组织中α-actinin-4、Synaptopodin和Nestin的 mRNA 表达(P<0.01),也可下调 Desmin 和 uPAR 的 mRNA 表达(P<0.05),益气清热膏组Vimentin的mRNA表达与模型组无显著差异(P>0.05)。益气清热膏组对Synaptopodin和Nestin的下调作用与环孢素组相当(P>0.05)。(4)Western Blot 结果:与假手术组相比,模型组 α-actinin-4、Synaptopodin、Desmin、Nestin、Vimentin和uPAR的蛋白表达水平显著升高(P<0.01)。与模型组相比,益气清热膏组的肾组织中α-actinin-4蛋白、Synaptopodin蛋白和Nestin蛋白表达显著减少(P<0.01),Desmin蛋白和uPAR蛋白表达明显下降(P<0.05),Vimentin蛋白表达无显著差异(P>0.05)。益气清热膏组对Nestin蛋白表达的下调作用与环孢素组相当,(P>0.05)。(5)ELISA结果:与假手术组相比,Rho相关GTP结合蛋白酶在模型组中表达显著升高(P<0.01);与模型组相比,益气清热膏可降低Rho GTP酶的表达(P<0.05)。环孢素组Rho GTP酶表达水平低于益气清热膏组(P>0.05)。结论:益气清热膏能有效降低PAN大鼠24h尿蛋白定量、改善肾功能;减轻肾小球病理损伤,改善足突融合,修复足细胞损伤,减轻PAN导致的肌动蛋白细胞骨架重排。其作用机制可能与下调肌动蛋白细胞骨架相关调控蛋白表达有关。实验二益气清热膏修复嘌呤霉素氨基核苷诱导足细胞骨架重排的研究目的:观察益气清热膏含药血清对PAN刺激足细胞损伤模型的干预作用。方法:离体培养条件永生性小鼠足细胞系,建立PAN致足细胞损伤模型,采用CCK-8法、LDH释放实验和免疫荧光法筛选最适造模浓度和干预时间(100μg/ml干预24h)。制备益气清热膏和环孢素含药血清,分为空白对照组(Control)、模型组(PAN)、益气清热膏低剂量组(YQ-L)、中剂量组(YQ-M)、高剂量组(YQ-H)和环孢素组(CsA),分别干预细胞。采用CCK-8法、LDH释放实验、流式细胞术、透射电镜、划痕实验、免疫荧光法、RT-PCR法和Western Blot法检测益气清热膏对足细胞活力、足细胞损伤、足细胞增殖和凋亡、细胞器形态学改变、足细胞活动能力、肌动蛋白骨架重排、肌动蛋白骨架相关蛋白和裂孔膜蛋白的mRNA及蛋白表达等方面的影响。结果:(1)足细胞损伤:与Control组比较,PAN组足细胞活力明显下降,LDH释放率明显升高(P<0.01);与PAN组相比,YQ-L组足细胞活力有所上升,LDH释放率无明显改变(P>0.05);YQ-M组、YQ-H组及CsA组足细胞活力明显上升,LDH释放率明显下降(P<0.01)。透射电镜结果显示,与Control组相比,PAN组细胞内出现大量脂滴沉积,可见内质网囊泡化扩张,线粒体嵴紊乱。与PAN组相比,YQ-M组、YQ-H组和CsA组足细胞损伤程度减轻,线粒体和内质网结构恢复。(2)细胞周期和细胞凋亡结果:流式细胞术检测结果显示,与Control组相比,PAN组G0-G1期细胞数增加、S期细胞数下降(P<0.01)。与PAN组相比,G0-G1期细胞数下降、S期细胞数上升(P<0.01);CsA组对G0-G1期细胞无明显影响,S期细胞数上升(P<0.01)。细胞凋亡结果显示,与Control组相比,PAN组足细胞的凋亡率明显上升(P<0.01);与PAN组相比,YQ-M组、YQ-H组和CsA组的细胞凋亡率均显著下降(P<0.01)。(3)运动能力和黏附能力:与Control组细胞相比,PAN组足细胞的迁移距离和迁移细胞数明显增加,黏附细胞数明显降低(P<0.01);与PAN组相比,YQ-M组、YQ-H组和CsA组足细胞的迁移距离显著降低,迁移细胞数显著减少(P<0.01)。YQ-M组和YQ-H组黏附细胞数增加(P<0.01)。(4)免疫荧光染色结果:PAN组足细胞胞体变小,胞内有残存的被切断的丝状结构,应力纤维减少,分布杂乱无序,细胞周围伸出许多小凸起和细胞棘,Synaptopodin表达增加,主要分布在细胞核周围。YQ-M组和YQ-H组上述损伤均减轻,其中YQ-H组细胞骨架形态优于YQ-M组,YQ-M组仍可见少许细胞棘,并在细胞内有肌动蛋白微丝构成的收缩环形成。YQ-M组Synaptopodin在细胞核周围仍有较高表达,YQ-H组可见Synaptopodin分布均匀,在细胞周围形成的板状伪足边缘呈颗粒状分布。与YQ-M组和YQ-H组相比,CsA组细胞骨架形态较差,胞体较小,应力纤维较少,未见明显极性分布,在细胞核周围可见大量排布紊乱的短小肌动蛋白束;Synaptopodin多聚集于细胞核周围。(5)RT-PCR 结果:与 Control组相比,PAN 组 α-actinin-4、Synaptopodin、Nestin、Desmin、Vimentin 和 uPAR 的 mRNA 水平显著增高,Nephrin 和 Podocin的mRNA水平显著降低(P<0.01)。与PAN组相比,YQ-H组可明显下调足细胞中 α-actinin-4、Synaptopodin、Nestin、Desmin 和 uPAR 的 mRNA 表达,上调 Nephrin 和 Podocin 的 mRNA 表达(P<0.01)。YQ-M 组和 YQ-H 组对Vimentin的mRNA表达无明显影响(P>0.05)。(6)Western Blot结果:与Control组相比,PAN组肌动蛋白骨架相关蛋白 α-actinin-4、Synaptopodin、Desmin、Nestin、Vimentin 和 uPAR 的蛋白表达水平显著升高,裂孔膜蛋白Nephrin和Podocin的蛋白表达水平显著降低(P<0.01)。与PAN组相比,YQ-H组可明显下调足细胞中Synaptopodin、Nestin和uPAR的蛋白表达、上调Nephrin的蛋白表达(P<0.01);也可下调α-actinin-4、Desmin和Vimentin的蛋白表达水平,上调Podocin的蛋白表达(P<0.05)。YQ-M组可下调uPAR的表达(P<0.01),对其余各蛋白表达无明显影响(P>0.05)。CsA 组可明显下调足细胞 α-actinin-4、Synaptopodin、Desmin、Nestin、Vimentin和uPAR的蛋白表达水平,上调Nephrin和Podocin的蛋白表达水平(P<0.05)。结论:益气清热膏能减轻PAN引起的足细胞损伤,促进足细胞增殖并减少其凋亡;降低足细胞的运动能力,增加其黏附能力;抑制肌动蛋白微丝重排,稳定细胞骨架,修复肌动蛋白骨架相关蛋白和裂孔膜蛋白的异常表达,发挥足细胞保护作用。实验三基于足细胞肌动蛋白骨架重排探讨益气清热膏对RhoA/ROCK信号通路的影响目的:观察益气清热膏是否是通过RhoA/ROCK信号通路抑制足细胞肌动蛋白细胞骨架重排。方法:离体培养条件永生性小鼠足细胞系,采用GLISA法检测益气清热膏对PAN致足细胞损伤中Rho家族小GTP酶关键分子RhoA、Rac1、Cdc42活性状态的表达情况,发现益气清热膏可明显上调RhoA的活性状态,对Rac1和Cdc42无明显影响。使用RhoA/ROCK信号通路抑制剂C3转移酶和RhoA/ROCK信号通路激动剂U46619分别与益气清热膏联合预处理。采用Transwell小室法、流式细胞术、免疫荧光法检测足细胞迁移能力、细胞周期变化、细胞骨架重排情况,采用Western Blot法检测RhoA/ROCK信号通路中RhoA和Rho相关卷曲蛋白激酶1(ROCK1)的表达水平,及其下游的关键分子肌球蛋白轻链(MLC)、肌球蛋白磷酸酶靶向亚基1(MYPT1)、LIM-激酶(LIMK)、切丝蛋白(Cofilin)等磷酸化水平以及球形肌动蛋白单体(G-actin)和丝状肌动蛋白纤维(F-actin)的相对表达量(G-actin/F-actin)。结果:(1)GLISA 结果:与 Control 组相比,PAN 组的 RhoA、Rac1、Cdc42的活性降低(P<0.01);相比于PAN组,YQQRG组RhoA活性明显上升(P<0.01),对Rac1和Cdc42的活性无明显影响(P>0.05)。与YQ组相比,益气清热膏和RhoA/ROCK信号通路抑制剂C3转移酶共同预处理后,RhoA活性下降(P<0.05);益气清热膏和RhoA/ROCK信号通路激动剂U46619共同预处理后,RhoA活性稍有上升(P>0.05)。(2)细胞周期结果:与PAN组相比,YQ组G0-G1期细胞数下降、S期细胞数上升(P<0.05)。与YQ组相比,加入RhoA/ROCK信号通路抑制剂C3转移酶预处理后G0-G1期细胞上升、S期细胞下降(P<0.05);加入RhoA/ROCK信号通路激动剂U46619预处理后G0-G1期细胞数继续下降(P<0.05)、S期细胞稍有上升(P>0.05)。(3)运动能力:与Control组相比,PAN组足细胞的迁移细胞数明显增加(P<0.01);与PAN组相比,YQ组的迁移细胞数显著降低(P<0.01)。与YQ组相比,加入RhoA/ROCK信号通路抑制剂C3转移酶预处理后,迁移细胞数增加(P<0.05);加入RhoA/ROCK信号通路激动剂U46619预处理后,迁移细胞数降低,差异无明显统计学意义(P>0.05)。(4)免疫荧光染色结果:PAN组胞体明显缩小,应力纤维减少,排列紊乱,细胞周围伸出许多小凸起和细胞棘;益气清热膏处理可改善上述细胞骨架结构的变化,应力纤维部分恢复正常排列;益气清热膏与RhoA/ROCK信号通路抑制剂C3转移酶共同预处理后,细胞骨架形态较差,细胞膜附近分布了大量排布紊乱的短小肌动蛋白束;益气清热膏与RhoA/ROCK信号通路激动剂U46619共同预处理后,细胞骨架形态优于单独益气清热膏预处理。(5)Western Blot 结果:与 Control 组相比,PAN 组 RhoA 和 ROCK1 的表达水平显著降低(P<0.01);与PAN组相比,益气清热膏组RhoA和ROCK1的表达水平升高(P<0.01)。与益气清热膏单独预干预相比,经益气清热膏与RhoA/ROCK信号通路抑制剂C3转移酶共同预处理后,RhoA和ROCK1的表达水平下降(P<0.01,P<0.05);经益气清热膏与RhoA/ROCK信号通路激动剂U46619共同预处理后,RhoA和ROCK1的表达水平上升(P<0.01,P<0.05)。对其下游分子,与Control组相比,PAN处理后MYPT1和MLC磷酸化水平下调,LIMK和Cofilin的磷酸化水平也下调,G-actin/F-actin 比值明显上升(P<0.01);与PAN组相比,益气清热膏干预后MYPT1和MLC磷酸化水平上升,LIMK和Cofilin的磷酸化水平上升,G-actin/F-actin 比值明显下降(P<0.01);与YQ组相比,益气清热膏和RhoA/ROCK信号通路抑制剂C3转移酶共同预处理可拮抗上述分子的磷酸化水平升高和G-actin/F-actin 比值下降(P<0.01,P<0.05);经益气清热膏与RhoA/ROCK信号通路激动剂U46619共同预处理后,益气清热膏的干预效应更为明显(P<0.01,P<0.05)。结论:益气清热膏可提高受损足细胞RhoA活性,对Rac1和Cdc42作用不明显。益气清热膏可通过激活RhoA/ROCK信号通路,促进足细胞增殖,降低足细胞的活动力,抑制细胞骨架重排,其作用机制可能是通过促进MLC和MYPT1的磷酸化水平;也促进LIMK和Cofilin的磷酸化水平,降低G-actin/F-actin 比值,稳定细胞骨架,发挥足细胞保护作用。全文结论:(1)益气清热膏可降低PAN模型大鼠蛋白尿水平,改善肾功能,减轻肾脏病理损伤。(2)益气清热膏能减轻PAN引起的体外培养足细胞损伤,抑制肌动蛋白细胞骨架重排,恢复肌动蛋白微丝的正常排布。(3)益气清热膏可通过激活RhoA/ROCK信号通路,促进MLC和MYPT1磷酸化;促进LIMK和Cofilin磷酸化,降低G-actin/F-actin 比值,稳定细胞骨架,发挥足细胞保护作用。