泛素特异性蛋白酶USP13是人类基因组编码的泛素特异性蛋白酶家族成员之一,基因位于3号染色体长臂3q26.2–q26.3区域,基因编码区由2,592个碱基组成,编码863个氨基酸。USP13是泛素特异性蛋白酶USP5的直系同源物,二者的序列具有大约80%的相似性。蛋白结构中包括四个UBP锌指结构域和一个USP结构域。而且UBP结构域中具有催化位点、锌指(Zn F)结构域,和两个泛素相关的UBA结构域,但二者的去泛素化酶活性和底物特异性均不相同。为了进一步明确USP13的去泛素化酶活性,本研究建立了三种去泛素化酶活性检测体系,利用三种不同类型的模型底物来验证USP13的去泛素化酶活性。除了了解USP13的活性,阐明其底物特异性及其调控的蛋白分子对于理解其生物学功能也至关重要。但是对于筛选去泛素化酶特异性底物的方法研究还相对匮乏。双向荧光差异凝胶电泳(two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis,2D-DIGE)是经典的查找差异蛋白的方法,该技术可检测到样品间小于10%的蛋白表达差异,具有统计学意义,已经被广泛应用于蛋白质组学研究领域。本研究首次采用2D-DIGE来筛选USP13调控的蛋白分子,研究其在去泛素化酶的特异性底物和调控蛋白分子筛选中的可行性。第一部分:泛素特异性蛋白酶USP13去泛素化酶活性的研究目的:USP13含有两个短且高度保守的片段即赖氨酸结构域(Cys box)和组氨酸结构域(His box),序列中含有起催化作用的三联残基,即Cys,His和Asp/Asn高度保守的结构域,理论上能将泛素分子从泛素化底物蛋白上移除。然而现有的研究提示USP13的去泛素化酶活性仍存在争议,需要进一步的研究证实。为了进一步明确USP13的去泛素化酶活性,本研究建立了三种去泛素化酶活性检测体系,利用三种不同类型的模型底物(模型底物Ub-Met-β-gal和GST-Ub52,以及荧光底物Ub-AMC)来验证USP13的去泛素化酶活性,同时构建了四个USP13的snp错义突变,检测其对于usp13活性的影响。方法:1构建pgex-usp13(c345s)和pac-t7-usp13(c345s)突变质粒:采用本科室保存的pgex-usp13(wt)质粒为模板,定点突变c345s位点,构建人的pgex-usp13(c345s)突变质粒。采用限制性内切酶bamhi酶切pac-t7载体质粒,将已构建成功的pgex-usp13(c345s)质粒用sali和noti酶切后连接到pac-t7载体质粒上构建pac-t7-usp13(c345s)突变质粒。2gst-usp13融合蛋白表达与精制:将pgex-usp13质粒转化bl21感受态细胞,低温(15℃)培养40小时,诱导gst-usp13融合蛋白表达,采用gsh-sepharoseresin精制gst-usp13融合蛋白。3构建pgex-usp13(a107v),pgex-usp13(r217q),pgex-usp13(g465s)和pgex-usp13(e669g)突变质粒:采用本室保存的pgex-usp13(wt)质粒为模板,定点突变a107v:320c>t,r217q:650g>a,g465s:1393c>t和e669g:2006t>c位点,构建人的pgex-usp13(a107v),pgex-usp13(r217q),pgex-usp13(g465s)和pgex-usp13(e669g)突变质粒。4去泛素化酶活性检测:采用ub-met-β-gal、gst-ub52模型底物和ub-amc荧光底物检测体系检测usp13的去泛素化酶活性。采用ub-met-β-gal模型底物活性检测系统检测usp13(a107v、r217q、g465s、e669g)四个突变体的去泛素化酶活性变化。结果:1pgex-usp13(c345s)和pac-t7-usp13(c345s)质粒的构建:pcr产物用sali和noti限制性内切酶进行酶切鉴定,结果显示,pgex-usp13(c345s)和pgex-usp13(wt)一样,均能被正确切开,且目的片段和预期大小一致。测序结果证实pgex-6p-1和pac-t7中成功插入了usp13(c345s)序列,证明定点突变和换载成功。2gst-usp13融合蛋白的精制:pgex-usp13表达质粒经15℃诱导40小时后,gst-usp13部分溶解,大部分存在于上清中,用gsh-sefinoseresin纯化gst融合蛋白,再经洗脱液洗脱,精制出gst-usp13融合蛋白。3usp13去泛素化酶活性检测:采用ub-met-β-gal、gst-ub52模型底物和ub-amc荧光底物检测体系检测usp13的去泛素化酶活性,虽然三个体系中均能检测到usp13的表达,但都没有检测到usp13的去泛素化酶活性。4pgex-usp13(a107v),pgex-usp13(r217q),pgex-usp13(g465s)和pgex-usp13(e669g)突变质粒的构建及去泛素化酶活性检测:pcr产物用sali和noti限制性内切酶进行酶切鉴定,结果显示,pgex-usp13(a107v),pgex-usp13(r217q),pgex-usp13(g465s)以及pgex-usp13(e669g)均和pgex-usp13(wt)一样,均能被正确切开,且目的片段和预期大小一致测序结果证实pgex-6p-17中成功插入了usp13(a107v)、usp13(r217q)、usp13(g465s)和usp13(e669g)序列,证明定点突变和换载体均成功。但用ub-met-β-gal模型底物活性检测系统均未检测usp13(a107v、r217q、g465s、e669g)四个突变去泛素化酶活性变化。结论:1采用ub-met-β-gal、gst-ub52模型底物和ub-amc荧光底物检测体系检测了usp13的去泛素化酶活性,但均未检测到,提示这三种方法不适用于检测usp13的体外活性。2成功构建了usp13失活突变体usp13(c345s)和四个错义突变体:usp13(a107v),usp13(r217q),usp13(g465s)和usp13(e669g),并采用ub-met-β-gal模型底物活性检测系统检测了其去泛素化酶活性变化,四个突变体活性与野生型usp13活性均未检测到。第二部分:应用双向荧光差异凝胶电泳(2d-dige)技术筛选usp13调控的蛋白分子目的:不同物种间泛素化蛋白的类型和长度多种多样,每种去泛素化酶可能有不同的底物特异性,部分去泛素化酶的这种底物特异性不能用模型底物测定,第一部分的研究证实,ub-met-β-gal、gst-ub52模型底物和ub-amc荧光底物检测体系均检测不到usp13的去泛素化酶活性,因此寻找usp13的特异性底物及其调控蛋白成为研究其去泛素化酶功能的关键。双向荧光差异凝胶电泳(2d-dige)是经典的查找差异蛋白的方法,该技术可检测到样品间小于10%的蛋白表达差异,具有统计学意义,但该技术是否适用于筛选usp13调控的蛋白分子则需要进一步的实验验证。因此本研究将2d-dige应用于筛选确定usp13调控的蛋白分子,研究其在去泛素化酶的特异性底物和调控蛋白分子筛选中的可行性。方法:1构建pegfp-usp13(wt)和pegfp-usp13(c345s)质粒:采用限制性内切酶salⅠ酶切载体质粒pegfp-c1,sali和noti酶切pgex-usp13(wt)和pgex-usp13(c345s)质粒,用5′filledin的方法分别进行平末端化后进行连接。利用限制性内切酶bamhⅠ酶切进行正反鉴定,酶切正向连接的即为构建成功的pegfp-usp13(wt)和pegfp-usp13(c345s)质粒。2细胞转染:将重组pegfp-c1、pegfp-usp13(wt)和pegfp-usp13(c345s)质粒分别转染hek293t细胞,从而使细胞系中分别过表达gfp、usp13(wt)和usp13(c345s)蛋白。3蛋白样品制备和纯化:pegfp-c1、pegfp-usp13(wt)和pegfp-usp13(c345s)质粒分别成功转染hek293t细胞,收集细胞,提取总蛋白,用苯酚抽提法进行纯化后定量,得到进行2d-dige的蛋白样品。4双向荧光差异凝胶电泳(2d-dige):将纯化后的蛋白质样品用不同的荧光染料标记,经2d-dige进行蛋白质分离,经typhoon9410扫描后,获得分辨率高、蛋白点分布趋势一致的蛋白表达谱。应用decyderdifferentialanalysissoftware对其进行分析,经过组间配比t检验分析,得到具有明显差异的蛋白点,用ettanspotpicker挖点进行后续质谱分析。结果:1pegfp-usp13(wt)和pegfp-usp13(c345s)质粒的构建:经平末端化后连接的质粒用bamhⅠ限制性内切酶进行正反鉴定,正向插入的切出1900bp和5500bp左右的两条带,1%琼脂糖凝胶电泳结果显示其中一条接近2000bp,另一条约为5500bp,与预期大小一致。测序结果也证实,pegfp-c1质粒中插入的2700bp左右片段为人类usp13的编码区,与genebank参考序列相一致。2pegfp-c1、pegfp-usp13(wt)和pegfp-usp13(c345s)质粒转染hek293t细胞:转染细胞24小时后荧光显微镜观察转染情况。结果显示:pegfp-c1、pegfp-usp13(wt)和pegfp-usp13(c345s)均成功转染至hek293t细胞中,三种转染细胞均表达了绿色荧光蛋白gfp。3蛋白样品制备与纯化:苯酚抽提纯化的总蛋白。用10%sds-page电泳验证纯化前后总蛋白量没有明显变化。用抗gfp抗体检测gfp、gfp-usp13以及gfp-usp13(c345s)蛋白均有表达。4gfp-usp13过表达与空白质粒gfp对比检测差异蛋白的表达:对照组(gfp)和实验组(gfp-usp13)样品各50μg分别加入0.5μlcy3-(绿色)和0.5μlcy5-(红色)来标记蛋白,然后通过双向荧光差异凝胶电泳分离蛋白点,经typhoon9410扫描,decyderdifferentialanalysissoftware分析,经过组间配比t检验分析,共得到11个具有明显差异且有相同变化的蛋白点。用ettanspotpicker挖点进行后续质谱分析。5gfp-usp13与gfp-usp13(c345s)过表达对比检测差异蛋白的表达:对照组(gfp-usp13c345s)和实验组(gfp-usp13)样品各50μg分别加入0.5μlcy3-(绿色)和0.5μlcy5-(红色)来标记蛋白,然后通过双向荧光差异凝胶电泳分离蛋白点,经typhoon9410扫描,decyderdifferentialanalysissoftware分析,经过组间配对t检验分析,共得到3个具有明显差异且有相同变化的蛋白点。用ettanspotpicker挖点进行后续质谱分析。结论:12d-dige技术适用于查找去泛素化酶相关蛋白的研究,灵敏度高、结果准确。2应用2d-dige技术对不同质粒转染的hek293t细胞蛋白进行分离,结果显示与空白质粒对照组比较,usp13高表达的细胞中蛋白质表达具有差异性,且部分差异蛋白可能与usp13的去泛素化酶活性相关,应进一步研究。第三部分:应用lc-ms/ms技术联合qrt-pcr及westernblot鉴定与验证差异蛋白目的:应用液相色谱-质谱联用(lc-ms/ms)技术对2d-dige分离出的差异蛋白质点进行鉴定,采用荧光定量pcr(qrt-pcr)和westernblot方法来进一步验证经质谱分析得到的差异蛋白质,分别验证蛋白质的mrna水平和蛋白表达水平在不同实验组间是否存在差异,从而进一步验证所得蛋白质是否与usp13的过表达有关,为进一步确定usp13的特异性底物以及调控的蛋白分子提供依据。方法:1质谱鉴定及数据库检索:应用液质联用仪ltqxl对样品进行质谱鉴定。应用bioworks3.3.1软件(thermofisherscientific)的sequest运算方法进行数据库检索。2荧光定量pcr检测差异蛋白的mrna水平:pegfp-c1、pegfp-usp13(wt)和pegfp-usp13(c345s)质粒转染hek293t细胞后,提取细胞中的总rna,用荧光定量pcr检测各个差异蛋白在不同处理组的mrna水平。3westernblot检测差异蛋白的表达水平:pegfp-c1、pegfp-usp13(wt)和pegfp-usp13(c345s)质粒转染hek293t细胞后,提取细胞中的总蛋白质,用westernblot检测差异蛋白在不同处理组的蛋白表达水平。结果:1质谱鉴定及数据库检索:11个差异表达蛋白点进行质谱鉴定,经质谱分析及数据库检索,成功鉴定出7种蛋白,usp13过表达后,表达上调的有4种,分别是细胞骨架蛋白(vinculin)、甲拌磷寡肽酶(thop1)、聚腺苷酸化裂解因子3(cpsf3)和甲基化蛋白50(wdr77);表达下调的有3种,分别是腺苷酸基琥珀酸合成酶(adss),膜联蛋白(annexin)和磷酸甘油酸变位酶(pgam1)。其中细胞骨架蛋白(vinculin)在usp13过表达与gfp及usp13c345s过表达比较时均有上调,提示vinculin的表达上调可能与usp13的去泛素化酶活性有关。2荧光定量pcr检测差异蛋白的mrna水平:转染pegfp-c1组和转染pegfp-usp13(c345s)组细胞mrna分别与转染pegfp-usp13(wt)组细胞的mrna之间进行比较,各个蛋白mrna表达水平均没有明显差别。说明usp13过表达不影响各个差异蛋白的mrna水平。3westernblot检测差异蛋白的表达水平:2d-dige结果显示,vinculin在USP13过表达时上调,而在USP13(C345S)过表达时蛋白水平不变。为了进一步验证,应用Western blot技术,对分别转染pEGFPC1、pEGFP-USP13(WT)和p EGFP-USP13(C345S)质粒的HEK293T细胞中vinculin蛋白表达进行分析,结果显示:vinculin蛋白在USP13(WT)组表达上调,与GFP组和USP13(C345S)组比较,差异有统计学意义。结论:1应用质谱分析成功鉴定出7种差异蛋白,可能与USP13过表达相关。为进一步研究USP13以及其相关蛋白的生物学功能提供了新的线索和方向。2通过Western blotting进一步验证了vinculin蛋白在USP13过表达时上调,但在USP13 C345S过表达时无变化,提示vinculin可能是USP13的特异性底物,但还需要进一步的实验验证。