本研究分为二部分： 第一部分、Twist基因RT-PCR方法的建立 目的：Twist是胚胎发育相关基因，编码一种在胚胎发育中起关键调控作用的转录因子，在诱导细胞移动及组织塑型中起重要作用。新近发现twist具有癌基因的特征，在人类肿瘤的发生、发展、愈后、复发中具有重要作用，在人类多种恶性肿瘤中高表达，在正常组织和恶性程度低的癌细胞中无或极低表达。Twist—因GC含量高（75%），局部区域GC含量高达90％以上，有连续的30个GC（NM—000474），具有复杂的二级结构，其逆转录聚合酶链式反应（Reverse transcription polymerase chain，RT—PCR）方法的建立是一项相当困难而又费力费时的工作。本课题以肾癌细胞系786—0、肝癌细胞系HepG2、胃癌细胞系MNK和人正常乳腺细胞系Hs578Bst为研究对象，建立twist基因的RT—PCR方法，为探讨twist在肿瘤尤其在肾癌中的作用机制奠定方法学基础。 方法：苏复液氮冻存的肾、肝、胃癌细胞和正常乳腺细胞株，加入RPMI1640液培养（含10%的小牛血清），置于CO2培养箱中（5%CO2、95%空气、37℃）培养，24h更换培养液，以后每2～3 d更换一次，倒置相差显微镜下观察细胞生长情况，待细胞生长铺满培养瓶底时传代或提取RNA。用RNA simple Total RNA kit提取细胞内总RNA，1%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性，紫外分光光度计定量检测浓度、纯度。cDNA合成按照Quantscript RT kit Quant cDNA第一链合成试剂盒说明书操作合成。PCR扩增所用引物设计根据GeneBank中的TW/ST（NM_000474）基因序列，运用Primer5.0引物软件并结合Olig06.0的评价分析，最后经Blast检索以确保每条引物与基因库人类已知的其它基因无同源性，同时以GAPDH为内参照基因并设计其引物。PCR扩增操作按照TAKARA公司的LA Taq with GC Buffer PCR试剂盒说明书，设置PCR反应体系并优化扩增反应条件，扩增产物经2.5%琼脂糖凝胶电泳后，照相保存。 结果：（1）总RNA的质量：提取的总RNA通过紫外分光光度计测量，A260/A280在1.80～2.10之间，A260/A2301.90～2.20之间，浓度大于300 ng/μl，通过1%琼脂糖凝胶电泳后，28S带比18S带明显，灰度比大于1，无拖尾；（2）采用TAKARA的LA Taq with GC buffer PCR试剂盒，通过PCR方案的优化，在肾癌细胞系786—0、肝癌细胞系HepG2和胃癌细胞系MNK中均扩增出twist基因的特异表达带。 结论：（1）成功摸索出了具有复杂二级结构、富含GC的twist基因的RT—PCR扩增方法；（2）RT—PCR结果显示在肾癌细胞系中存在twist基因的特异表达。 第二部分、PAB-Gal4-DBD-HA-Twist重组质粒的制备 目的：TWIST蛋白是一种在胚胎发育中起关键调控作用的转录因子，属于碱性的螺旋一环一螺旋（bHLH）蛋白家族成员，在不同的种属之间其核苷酸和氨基酸序列高度保守，其能与DNA上E—BOX的5’—CANNTG—3’序列结合并且能借助HLH形成特定的同源或异源二聚体，广泛参与调控器官生长发育、肿瘤发生、细胞增殖分化等过程，并赋予细胞迁移的能力，还能介导上皮细胞一间叶细胞的转变（Epithelial—Mesenchymal transition，EMT）及细胞的迁移，是上皮间质变过程中的重要调控因子。本实验拟采用PCR和分子克隆技术，构建人Twist基因的表达载体pAB—Ga14—DBD—HA—Twist，为进一步研究其转录调控作用提供实验工具。 方法：（1）设计带有酶切位点BamHⅠ和HindⅢ的特异引物，对重组克隆质粒pcDNA—Flag—Twist进行PCR扩增，得到含有酶切位点的Twist基因编码区全长序列：（2）对含有酶切位点的Twist基因全长片段和pAB—Ga14—DBD—HA表达载体进行BamHⅠ和HindⅢ双酶切反应，电泳分离，胶回收纯化后，进行连接反应；（3）将连接反应产物转入感受态大肠杆菌中，过夜培养；（4）菌落PCR，提取阳性重组质粒作限制性内切酶分析和序列测定。 结果：（1）限制性核酸内切酶酶切鉴定表明，构建的重组质粒中含有与Twist基因编码区全长一致的650 bp片段；（2）DNA测序结果经BLAST分析显示：与GenBank数据库twist基因（NM_000474）序列完全一致，同源性为100%。 结论：成功构建了人twist基因的表达质粒，为下一步研究分析twist基因的表达调控作用和机制奠定基础。