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研究背景:氧化应激是造成血管内皮细胞生理功能损伤,进而引起高血压、动脉粥样硬化等血管疾病的主要因素之一。心血管疾病中调控氧化应激的相关病理生理机制尚不明确。FAT10作为类泛素家族中的一员,目前发现在自噬、凋亡、炎症、肿瘤等方面均有重要作用。氧化应激的重要参与者线粒体活性氧(mtROS)主要由线粒体呼吸链复合物I、III生成。FAT10对mtROS的具体调节机制尚未见报道,有待进一步研究。研究目的:研究类泛素蛋白FAT10通过调控呼吸链复合物升高mtROS的具体机制。研究方法:人脐静脉内皮细胞(HUVECs)以及HEK293细胞用于实验研究。给予HUVECs以下处理方式:(1)分为3组(n=6),分别为阴性病毒对照(ad-Ctrl)组、FAT10过表达(ad-Fat10)组及FAT10干扰表达(sh-Fat10)组,给予以下两种处理方式:(1)使用线粒体呼吸链复合物活性检测试剂盒检测线粒体复合物I、III的活性,(2)使用Western-Blot测定呼吸链复合物蛋白表达情况;(2)使用Western-Blot测定蛋白合成抑制剂放线菌酮(CHX)对过表达FAT10调控呼吸链复合物蛋白表达情况的影响(n=6);(3)利用MG132处理HUVECs,使用Western-Blot测定呼吸链复合物蛋白的降解情况(n=6);(4)利用自噬抑制剂CQ及自噬激动剂Rapamycin处理HUVECs,使用Western-Blot测定呼吸链复合物蛋白随着自噬水平降低及升高表达情况的改变(n=6);(5)使用Western-Blot检测过表达FAT10对自噬水平的影响(n=4)。给予HEK293以下处理方式:使用HEK293细胞共转染FAT10质粒及各呼吸链复合物蛋白质粒,进行CO-IP实验,检测FAT10与何种呼吸链复合物蛋白相互作用;对于与FAT10存在相互作用的呼吸链复合物蛋白,构建其突变质粒,再与FAT10进行CO-IP实验,检测相互作用改变情况。研究结果:(1)与ad-Ctrl组相比,ad-Fat10组线粒体呼吸链复合物I活性升高(p<0.01),sh-Fat10组线粒体呼吸链复合物I活性降低(p<0.05);与ad-Fat10组相比,sh-Fat10组线粒体呼吸链复合物I活性降低(p<0.05);各组呼吸链复合物III活性无显著差异;表明FAT10对呼吸链复合物I的活性具有调控作用。(2)与ad-Ctrl组相比,ad-Fat10组中线粒体呼吸链复合物蛋白NDUFS2、NDUFAF1和NDUFC2表达量均显著升高(p均<0.01),Cytochrome C、COXⅣ、SDHA蛋白表达量无显著变化;与ad-Ctrl组相比,sh-Fat10组中线粒体呼吸链复合物蛋白NDUFS2、NDUFAF1和NDUFC2表达量均降低(p均<0.05),Cytochrome C、COXⅣ、SDHA蛋白表达量无显著变化;与ad-Fat10组相比,sh-Fat10组中线粒体呼吸链复合物蛋白NDUFS2、NDUFAF1和NDUFC2表达量均降低(分别p<0.05,p<0.01,p<0.05),Cytochrome C、COXⅣ、SDHA蛋白表达量无显著变化;表明FAT10对呼吸链复合物相关蛋白的表达有调控作用。(3)CO-IP实验显示FAT10与线粒体呼吸链复合物蛋白NDUFAF1存在相互作用,表明FAT10可能可以直接调控NDUFAF1蛋白。(4)使用放线菌酮(CHX)处理HUVECs转染ad-Fat10组及ad-Ctrl组,ad-Fat10组NDUFAF1蛋白升高(p<0.05);使用MG132处理HUVECs,内源性NDUFAF1蛋白表达随着MG132的作用时间延长无明显变化;使用自噬抑制剂CQ处理HUVECs,随着自噬水平的下降,NDUFAF1蛋白表达升高(p<0.05);使用自噬激动剂Rapamycin处理HUVECs,随着自噬水平的升高,NDUFAF1蛋白表达降低(P<0.001);表明NDUFAF1蛋白受自噬调控。(5)与ad-Ctrl组相比,ad-Fat10组自噬水平降低(p<0.01),表明过表达FAT10可以降低自噬水平。结论:(1)过表达FAT10升高线粒体呼吸链复合物I活性,升高线粒体呼吸链复合物蛋白NDUFS2、NDUFAF1、NDUFC2的表达量,影响mtROS生成;(2)FAT10与线粒体呼吸链复合物蛋白NDUFAF1存在直接相互作用,FAT10调控NDUFAF1蛋白;(3)NDUFAF1蛋白受自噬调控;(4)过表达FAT10降低自噬水平,从而稳定NDUFAF1蛋白。