研究目的:肝癌是世界上第五大最常见的癌症,也是癌症相关死亡的第三大原因,同时我国也是肝癌的高发国家。在原发性肝癌中,肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最主要的病理类型,占肝癌总数的80-90%。虽然目前各种治疗手段都取得了进展,但是HCC的复发与转移一直是影响患者生存率的重要因素。有研究表明约90%的肿瘤患者死亡是因为发生转移,因此阻断HCC转移是降低患者死亡率和改善预后的一个关键点。深入研究HCC的转移机制是寻找有效阻断靶点的基础,但是肿瘤转移是一个多步骤细胞生物学过程的最终产物,包括从原发灶的侵袭与迁移、在循环系统中的扩散、到达转移器官后的定植和增殖等,每一步骤都受到复杂的机制调控,给肿瘤转移机制的研究带来了挑战与困难。环状RNA属于非编码中RNA中的一类,是重要的表观遗传学调控分子。随着测序技术和生物信息学技术的高速发展,大量的环状RNA被发现,同时其作用机制也被揭示出来,包括作为mi RNA海绵(mi RNA sponge)发挥用、作为分子支架提供反应平台、调控亲本基因的表达、作为翻译模板编码肽并发挥生物学作用。环状RNA通过以上机制在肿瘤的发生发展中发挥重要的调节作用,但是在肿瘤转移中的作用还有待于进一步挖掘。本研究旨在寻找HCC转移过程中有重要作用的环状RNA分子,并探索其作用机制,为临床上预防和阻断HCC患者肿瘤的转移提供新的理论基础和治疗靶点。研究方法:肿瘤干细胞(Cancer stem cells,CSCs)是肿瘤转移的关键群体,首先我们从HCC患者原发灶中采用悬浮培养富集肝癌干细胞,利用第二代高通量测序和生物信息分析筛选在肿瘤干细胞中表达异常的环状RNA。我们采用RNAaes R处理RNA样本,并设计特异性的扩散和聚合引物,结合实时定量PCR的方法进行结构验证。我们发现hsa＿circ＿0003596(后面简称为circ3596)在肝癌干细胞中异常低表达并选为目标分子。我们使用了RNA免疫共沉淀和表达干扰技术寻找促进circ3596形成的RNA结合蛋白。我们通过构建circ3596的过表达载体在肝癌细胞系中过表达circ3596,并采用q RT-PCR法和荧光显微镜验证过表达效果。接下来我们通过CCK8、transwell、细胞划痕等实验在体外检测circ3596过表达后对肝癌细胞系生物学功能的影响。我们分别采用q RT-PCR和蛋白质免疫印记(western blot)检测circ3596对其亲本基因COL5A1表达的影响,并采用生物信息学分析和transwell试验进一步验证COL5A1对肝癌细胞系生物学功能的影响。研究结果:我们通过二代测序技术发现,悬浮培养富集后的肝癌干细胞与贴壁培养的普通肝癌细胞相比,表达具有统计学差异的环状RNA共193个;其中与普通肝癌细胞(Non-sphere)相比,在肝癌干细胞(Sphere)中上调的有82个,下调的有111个,其中环状RNA circ3596明显下调。干扰RNA结合蛋白TDP43的表达后,circ3596表达量明显下调,RNA免疫共沉淀试验提示TDP43可以与circ3596的线性前体特异性结合。我们的体外实验数据提示,虽然circ3596对肝癌细胞增殖能力的没有显著影响,但是circ3596可以显著抑制肝癌细胞的侵袭和迁移能力。在机制研究中我们发现circ3596降低其亲本基因COL5A1的蛋白水平。生物信息学分析和生物学功能试验显示COL5A1在体外具有促进肝癌细胞转移的能力。结论:通过以上研究,我们发现了环状RNA circ3596可以通过抑制其亲本基因COL5A1抑制肝癌细胞的侵袭和迁移能力。这些结果提示circ3596是细胞中本身存在的能够抑制肝癌转移的环状RNA,可能为开发用于阻断肝癌转移的药物提供候选分子。