研究背景与目的重症肌无力(myastheniagravis,MG)是自身抗体介导的自身免疫性疾病。可由多种抗体介导,其中多数患者表现为乙酰胆碱受体(acetylcholine receptor,AChR)抗体阳性。研究证实,针对AChR抗原产生自身抗体需要T细胞辅助,半数以上MG患者存在胸腺瘤、胸腺增生等异常,切除胸腺后患者症状可以缓解,因此认为MG的发生和发展与胸腺异常密切相关。尤其是在异常增生的MG胸腺中可见生发中心并从中分离出产生针对AChR的自身抗体。为探讨MG患者胸腺异常增生的机制,我们首先选取增生型MG患者胸腺组织进行“人类信号转导通路发现者PCR芯片”分析,观测10类常见的信号转导通路,通过对该芯片结果的分析,发现MG胸腺组织多种信号分子与对照组显著差异表达,结合相关文献和本课题组的研究工作基础,我们选择差异表达倍数较高的FOSL1(Fos related antigen-1)作为研究的核心内容。根据课题组相关研究发现,FOSL1主要表达于胸腺上皮细胞(thymus epithelial cells,TECs),为进一步明确FOSL1高表达对TECs功能和胸腺细胞增殖的影响,我们分离出TECs和胸腺细胞,通过构建慢病毒FOSL1基因表达和干扰表达载体转染TECs,观察TECs相关信号分子SOCS3、STAT3、BCL2、BAX基因表达的变化,以及TECs对胸腺细胞增殖的影响。材料与方法1.研究对象实验组:临床确诊的MG患者15例,男7例,女8例,年龄21.5±6.17岁。研究纳入标准符合下列5项指标,①具有典型的肌无力症状,眼睑下垂或肢体无力,晨轻暮重,疲劳试验症状加重;②新斯的明试验阳性;③血液中针对乙酰胆碱受体(AChR)的自身抗体阳性;④接受胸腺切除术治疗,症状缓解;⑤胸腺病理检查未见典型胸腺瘤,属于胸腺增生型。对照组:非自身免疫性心脏病且行开胸手术者15例,男9例,女6例,年龄18.3±4.23岁,与实验组没有显著差异。自身抗体阴性,无感染性疾病。样本采集不增加患者损伤并经患者或家属知情同意,符合医学伦理。2.胸腺组织样本采集、保存和运输将手术切除的新鲜胸腺组织,放置于无菌生理盐水中,1h内冷藏运输至实验室。在实验室首先用生理盐水对样本进行清洗、切除坏死组织和筋膜,4h内完成RNA提取、细胞分离培养、组织切片等相关实验。样本处理全过程在冰上、低温条件下进行。其中RNA提取用样本每50mg加入1 mL Trizol试剂后制成匀浆,-80℃冰箱或液氮保存。干冰运输。3.RNA提取、纯化、cDNA合成无菌获取手术切除的胸腺组织块,约50mg,加入1ml TRIZOL试剂制成匀浆。氯仿-水相分离法提取总RNA,消化灭活基因组DNA、并用RNeasy(?)MinEluteTM纯化试剂盒(Qiagen)对RNA进行纯化。常规加入oligo(dT)18、总RNA、dNTPs后定容、65℃水浴。再依次加入第一链Buffer、DTT、RNA酶抑制剂和SuperScriptⅢ RT进行cDNA合成。-20℃保存。4.PCR芯片分析从15例MG患者和15例对照组胸腺组织RNA中分别选取3例,委托上海康成生物工程公司进行PCR Assay。选择含有84个信号分子的“人类信号转导途径发现者PCR芯片”。该芯片中的信号分子分别属于TGFβ信号通路、WNT信号通路、NF□B信号通路、JAK/STAT信号通路、p53信号通路、Notch信号通路、Hedgehog信号通路、PPAR信号通路、Oxidative Stress通路和Hypoxia通路。5.荧光定量PCR验证试验根据芯片结果,对15例患者和对照组胸腺组织进行了基因表达验证实验。从GENE数据库查询FOSL1、CCL5和SOCS3基因序列,采用Primer5.0设计引物,按照SYBRPremix Ex Taq TM(TaKaRa公司)产品说明书进行操作。每个样本做3个复孔,冰上配制每孔20μL反应体系,加入八联排孔中。ABI 7500Fast荧光定量PCR仪中进行反应。导出原始数据,统计分析。6.胸腺上皮细胞(TEC)分离培养、鉴定和FOSL1基因转染取新鲜胸腺组织,去除筋膜和血污,剪成碎块,接种到6孔板,加入含10%胎牛血清(HyClone)和青霉素、链霉素的Dulbecco’s改良的Eagle’s培养液。37℃5%CO2环境中培养,隔天半量换液,培养7d后观察单个细胞集落形成情况。随机选择5-10个细胞集落,转移到新另一新培养皿继续培养,倒置显微镜观察生长情况,并进行CK8/18单抗染色,对分离的细胞进行鉴定。选取CK8/18+的细胞克隆进行下一步实验。委托公司构建FOSL1慢病毒表达载体(pCDH-CMV-MCS-EF 1-copGfp-FOSL1)和干扰载体(pMAGic7.1-FOSL1shRNA)。取2×105个生长状态良好的TECs,加入2×107TU/mL的慢病毒载体,倒置荧光显微镜下观察感染效率>85%。实验分组:FOSL1基因转染表达组(FOSL1组)、FOSL1表达干扰组(FOSL1-sh组)、过表达的空载体对照组(control)、干扰表达的空载体对照组(control-sh)。加入慢病毒载体后继续放置于37℃5%CO2培养箱中孵育7d,每天观察,记录实验结果。7.FOSL1基因转染或干扰表达对TECs SOCS3及相关信号分子表达的影响收集FOSL1基因转染前后的TECs,PBS洗涤后,提取RNA,经纯化、反转录和荧光定量PCR扩增(参考前述1.4和1.6的方法),分析TEC表达FOSL1、SOCS3及相关信号分子mRNA水平的变化。离心收集各组TEC,计数。用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液(RIPA)裂解细胞,PierceTMBCA 蛋白检测试剂盒(Thermo Fisher Scientific)测定蛋白浓度。将蛋白样品100加热10min,经SDS-PAGE电泳,采用半湿蛋白转印,5%脱脂乳阻断2h,按照常规方法依次加入一抗和辣根过氧化物酶(ZSGB-BIO)标记的二抗,孵育,在 ImageQuant LAS 4000mini Gel 成像系统(GE Healthcare)成像,蛋白表达通过ImageJ量化。β-actin为参照。8.胸腺细胞增殖实验将无菌胸腺组织按上法剪碎,通过机械挤压过100目不锈钢网,获得单个细胞悬液。室温静置2h,去除贴壁细胞,将悬浮细胞用PBS洗2次,进行细胞计数,调整细胞浓度为1 × 105/mL。将FOSL1组、FOSL1-sh组和两个对照组TEC按5.0×103个/孔接种于96孔培养板,待其完全贴壁(8h)后按1:10比例加入胸腺细胞,在1640培养基(含10%胎牛血清)37℃、5%CO2条件下继续培养24h、48h和72h,在培养结束前4h每孔加入5 mg/mL MTT溶液10 μL。每孔加DMSO 150 μL震荡10min溶解细胞释放甲臜颗粒,450nm波长全自动酶标仪测定吸光度值(A值),每组3个复孔。9.数据分析和统计学处理统计学意义评估采用两独立样本t检验,单因素方差分析,检验水准α=0.05,P<0.05为有显著性差异。数据处理用GraphPad Prism version5软件进行处理。结果1.MG患者胸腺组织差异表达基因将芯片中的MG患者胸腺组织信号转导分子mRNA与对照组进行对比分析,发现有显著差异的基因22个(差异倍数大于2),其中18个基因在MG患者表达显著增高,4个基因表达显著降低。包括ADM、BAX、BCL2A、CDKN1 A、CEBDP、CSF1、EGFR、EMP1、FOSL1、GADD45A、GADD45B、ID1、IRF1、ICAM1、HES1、SERPINE1、SOCS3、WISP1 和WNT2B等,这些信号分子涉及 TGF-β、Notch、JAK/STAT、NF-κB、WNT等多条信号通路。其中BCL2A、FOSL1、SOCS3的差异倍数大于5。2.荧光定量PCR验证为证实芯片中mRNA表达的准确性,对15例MG患者和对照组胸腺RNA选取FOSL1、SOCS3、CCL5进行荧光定量RT-PCR,MG患者胸腺组织SOCS3、FOSL1的表达与对照组相比有显著差异,P<0.05,而CCL5的表达在两组中没有显著差异,这些均与芯片结果一致。3.FOSL1基因转染影响TECs相关信号分子表达从胸腺组织分离TECs进行克隆培养和免疫组化鉴定,选择CK8/18染色阳性的TECs继续培养,将FOSL1慢病毒表达载体和干扰载体分别转染传代生长良好的TECs,观察转染效率和基因转染前后TECs信号分子的表达。结果显示,FOSL1基因转染组(39.01±0.72)与空载体对照组(1.85±0.21)及空白对照组相比,FOSL1 mRNA表达显著增加,P<0.01;SOCS3(3.30±0.58)、STAT3(8.56±0.61)、BAX(10.11±0.67)和BCL2(4.31±0.97)表达也相应增加,与阴性对照组(1.01±0.66、1.39±0.55、2.18±0.89、1.63±0.11)相比有显著差异,P<0.05。FOSL1基因敲低FOSL1-sh组(0.25±0.11)与空载体组(1.10±0.08)及空白对照组相比,FOSL1 mRNA表达显著降低,P<0.01;SOCS3表达也随之降低(0.18±0.04),与空载体组(0.89±0.14)相比有显著差异,P<0.01;但STAT3(6.33±0.96)、BAX(2.69±0.23)和BCL2(5.72±0.88)的表达仍显著高于阴性对照组(0.92±0.21、1.33±0.53、0.90±0.75),P<0.01。收集FOSL1转染组和干扰组TECs,裂解细胞提取蛋白,western-blot结果显示,SOCS3和BCL2蛋白水平在FOSL1转染组均显著高于FOSL1干扰组,P<0.05。4.FOSL1高表达TECs促进胸腺细胞增殖通过TECs与胸腺细胞共培养,发现FOSL1高表达的TECs能促进胸腺细胞增殖,共培养24h、48h和72h的细胞增殖吸光度值0.34±0.01、0.58±0.04、0.73±0.03与对照组(0.27±0.02、0.44±0.03、0.37±0.02)相比,48h和72h共培养后胸腺细胞增殖有显著差异P<0.05;FOSL1低表达的TECs对胸腺细胞增殖无显著影响,与对照组相比,P>0.05。结论FOSL1在MG患者增生性胸腺组织高表达,通过调控TECs功能而影响胸腺细胞增殖,参与MG胸腺异常增生。