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目的糖尿病肾病是糖尿病的严重并发症,是导致糖尿病肾病患者致残和死亡的主要原因之一。足细胞损伤被认为是引起糖尿病肾病蛋白尿和肾小球硬化的关键因素。因此,探讨足细胞损伤的机制并寻找有效可行的干预足细胞损伤的药物是解决问题的关键。活性维生素D3对糖尿病肾病具有显著的肾保护作用,但其机制尚未阐明。本研究通过构建STZ诱导的糖尿病肾病大鼠模型及体外足细胞培养模型两方面,观察活性维生素D3对糖尿病肾病足细胞的保护作用,同时探讨可能机制。方法将SD雄性大鼠随机分为四组：正常对照组(NC组)、活性维生素D3干预组(VD组,骨化三醇0.1μg·kg-1·d-1灌胃)、糖尿病肾病组(DN组,腹腔注射STZ 58mg·kg-1)和糖尿病肾病+活性维生素D3组(DN+VD组),定期检测血糖、体质量,收集尿标本,干预18w末处死动物,检测Scr、BUN、Ca、P和24小时尿蛋白变化,PAS和MASSON染色观察肾脏病理改变,电镜观察足细胞超微结构变化。体外研究采用体外培养小鼠永生系足细胞,对分化的足细胞予不同的刺激,观察1,25(OH)2D3、TRPC6抑制剂SKF-96365以及PI3K抑制剂LY294002对高糖诱导足细胞损伤的影响。免疫组化法检测肾组织WT-1、Nephrin、 Podocin、Desmin、VDR和p-Akt;免疫荧光法检测肾组织TRPC6表达以及足细胞Nephrin、Podocin、Desmin 及 TRPC6; Real-time PCR、Western Blot检测肾组织VDR、足细胞裂孔隔膜蛋白Nephrin、Podocin、TRPC6、足细胞损伤标志Desmin和PI3K/p-Akt信号通路相关分子表达。结果(1)体内研究表明,与DN组相比,DN+VD组蛋白尿减低达36%,肾脏病理损伤减轻,足细胞损伤减轻,血糖、体质量以及血尿素氮之间无差异(均P>0.05)；血肌酐、钙、磷在四组之间未见差异(均P>0.05)。与NC组相比,DN组Podocin、 Nephrin表达量均明显减低(均P<0.05),足细胞损伤标志Desmin蛋白表达量显著增加(P<0.05)。与DN组相比,DN+VD组Podocin、Nephrin表达量均明显增加(均P<0.05),足细胞损伤标志Desmin表达量显著减低(P<0.05)。WT-1在四组之间未见统计学差异。体外研究也证实,与对照组相比,30mmol/L高糖呈时间依赖的下调Nephrin以及Podocin的表达,上调Desmin的表达,且在24h达高峰。与高糖组相比,1,25(OH)2D3呈浓度依赖的上调Nephrin以及Podocin的表达,下调Desmin的表达,且100 nmol/L1,25(OH)2D3的浓度效果最佳。上述实验结果证实,足细胞损伤是糖尿病肾病的早期典型特征,活性维生素D3对高浓度葡萄糖状态下足细胞损伤有保护作用。 (2)进一步探讨Nephrin-PI3K/p-Akt信号通路在活性维生素D3保护足细胞中的作用发现,与NC组相比,DN组PI3K-p85、 p-Akt表达量均明显减低(均P<0.05)。与DN组相比,DN+VD组PI3K-p85、p-Akt表达量均明显增加(均P<0.05),相关性分析显示,Nephrin与PI3K-p85及p-Akt呈明显的正相关(r=0.736,P<0.05;r=0.855,P<0.05)。高糖干预足细胞24h后,PI3K、p-Akt蛋白表达明显减少,给予1,25(OH)2D3可显著上调PI3K, p-Akt蛋白的表达,而对总的Akt蛋白的表达无影响,在1,25(OH)2D3加用PI3K抑制剂LY294002后,足细胞的损伤尚未得到改善,与高糖组相似。(3)观察在活性维生素D3治疗糖尿病肾病足细胞损伤的一个可能的关键靶点TRPC6的表达变化发现,与NC组相比,DN组VDR表达量均明显减低(P<0.05),而TRPC6表达显著升高。与DN组相比,DN+VD组VDR表达量明显增加(P<0.05),而TRPC6下调(P<0.05)。相关性分析显示,TRPC6与Nephrin(r=-0.752、P<0.05)、VDR(r=-0.685、P<0.05)呈负相关,而与24小时尿蛋白(r=0.739、P<0.05)、Desmin (r=0.947、P<0.05)呈正相关。高糖干预足细胞24h后,VDR mRNA以及蛋白表达明显减少,TRPC6 mRNA以及蛋白表达明显增加,给予1,25(OH)2D3可显著上调VDR,减少TRPC6表达。给予TRPC6抑制剂SKF96365干预后,足细胞的损伤得到改善,同时伴随PI3K、p-Akt蛋白的表达上调。结论1)足细胞损伤是糖尿病肾病的早期典型病理特征,活性维生素D3对高浓度葡萄糖状态下足细胞损伤有保护作用。2)高浓度葡萄糖环境下,Nehrin-PI3K/p-Akt信号通路的下调介导足细胞损伤,活性维生素D3能够通过稳定该信号通路减轻足细胞损伤,从而缓解DN的进展。3)高浓度葡萄糖状态下TRPO6表达增高在足细胞损伤过程中起着重要作用,阻断THPO6的高表达可能是活性维生素D3调节Nephrin-PI3K-p-Akt信号通路发挥足细胞保护作用的关键环节。