实验一:草鱼CTGF基因的全长克隆、生物信息学分析及组织差异表达CTGF(Connective tissue growth factor)是即结缔组织生长因子,参与细胞增殖、迁移、粘合和细胞外基质的形成,在胚胎发生、血管生成、伤口修复及纤维化疾病的发生中发挥着重要作用。本实验采用c DNA末端快速扩增法首次克隆获得草鱼CTGF基因全长序列,对其编码蛋白质序列的特性进行预测和分析,并采用实时荧光定量PCR法检测草鱼各组织CTGF基因的差异表达。结果表明,草鱼CTGF基因全长2223 bp,所编码343个氨基酸;草鱼CTGF基因编码的氨基酸序列与团头鲂、斑马鱼、鲤鱼、墨西哥脂鲤CTGF的氨基酸序列同源性分别达98%、96%、91%、91%;生物信息学分析显示草鱼CTGF蛋白分子量为37978.2,理论等电点为8.22,为亲水性分泌蛋白,在多肽链1-21氨基酸残基段存在信号肽;其二级结构包括α-螺旋(α-helix)、β-重叠股(β-strand)和环(loop)。组织差异性表达分析显示CTGF基因在肌肉、皮肤、肝脏、心脏、脑、鳃、前肠、血液和脾脏均有表达,其中在血液和脾脏中表达量最高,心脏和鳃组织次之,皮肤、肌肉、肾脏、脑和前肠组织表达量较低,肝脏组织中的表达量最低。实验二:草鱼ROCK1基因的全长克隆、生物信息学分析及组织差异表达ROCK1是Rho激酶(ROCK)家族的成员之一,ROCK家族是Rho蛋白的下游效应因子,被Rho蛋白激活后ROCK作用于下游的效应分子,对其介导的信号通路进行调节,参与细胞增殖、迁移、形态改变等。在组织纤维化、癌症、心血管等疾病中发挥着重要作用。本实验采用c DNA末端快速扩增法首次克隆获得草鱼ROCK1基因全长序列,对其编码蛋白质序列的特性进行预测和分析,并采用实时荧光定量PCR法检测草鱼各组织ROCK1基因的差异表达。结果表明,草鱼ROCK1基因全长4604 bp,编码1361个氨基酸;草鱼ROCK1基因编码的氨基酸序列与金线鲃、斑马鱼、鲤鱼ROCK1的氨基酸序列同源性分别达95%、94%、94%;生物信息学分析显示草鱼ROCK1蛋白分子量158035.73,理论等电点5.69,为亲水性非分泌蛋白,不存在信号肽;其二级结构包括α-螺旋(α-helix)、β-重叠(β-strand)和环(loop)。组织差异性表达分析显示ROCK1基因在肌肉、皮肤、肝脏、心脏、脑、鳃、前肠、血液和脾脏均有表达,其中在脑和血液中表达量最高(P<0.05),其次为鳃、心脏、肾脏、脾脏和前肠组织,肌肉和肝脏组织表达量较低,皮肤组织表达量最低。实验三:投饲蚕豆对草鱼肌肉和皮肤组织TGFβ1-CTGF信号通路及胶原基因表达的影响本实验以投喂配合饲料的草鱼为对照组,以干蚕豆浸泡24h后投喂的草鱼为实验组(也称蚕豆组),对两组鱼进行为期12周的养殖,并分别于0周、4周、8周和12周采集肌肉和皮肤组织,采用荧光定量法测定蚕豆组和对照组肌肉和皮肤组织TGFβ1、CTGF、ROCK1、COL1A1及COL1A2基因的时空表达。结果显示,蚕豆组皮肤和肌肉组织TGFβ1、CTGF、COL1A1及COL1A2基因4个时期的表达量变化趋势一致,均在4周达到最高且显著高于对照组,8周和12周时则显著降低。蚕豆组肌肉组织ROCK1基因在4周时的表达量达到最高,但4周、8周和12周的表达量均低于对照组,而皮肤组织ROCK1在4周、8周和12周逐渐降低,且均低于对照组。蚕豆确实影响了草鱼TGFβ1、CTGF、ROCK1、COL1A1和COL1A2的表达,TGFβ1、CTGF和ROCK1基因参与调控COL1A1和COL1A2的表达。由结果推测认为蚕豆饲喂前期可能通过促进TGFβ1-CTGF信号通路刺激TGFβ1、CTGF的高表达,进而促进胶原蛋白的合成;同时蚕豆饲喂后期可能抑制了ROCK1的表达,进而其对TGFβ1-CTGF信号通路的促进作用减弱,表现为后期胶原蛋白合成的降低,相关分子调控机制值得进一步深入研究。