(S)-吲哚啉-2-甲酸的生物法制备工艺研究

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(S)-吲哚啉-2-甲酸是高血压治疗药物培哚普利的关键手性中间体,其生产成本和纯度会影响下游药物的价格和品质。工业上获得光学纯的(S)-吲哚啉-2-甲酸的方法主要以化学拆分为主。此类方法缺点在于拆分试剂昂贵、回收操作繁杂且拆分剂回用率低,增加生产成本的同时也对环境造成了巨大的压力。也有报道采用不对称合成法及手性源合成法直接合成(S)-吲哚啉-2-甲酸,但反应步骤多,得率较低的问题,阻碍了此类技术的产业化应用。目前,国内外采用生物法制备(S)-吲哚啉-2-甲酸的研究较少,选择性水解外消旋底物直接获得S构型的酸的工艺研究还未见报道。因此,建立一种生物法一步拆分制备高光学纯度的(S)-吲哚啉-2-甲酸的方法,不但能够提供一种新的制备思路,而且符合环保高效的产业发展趋势。本课题主要从三个方面进行研究,确定合适的拆分条件并对其工艺路线进行优化,主要研究结果如下:1.以(R,S)-吲哚啉-2-甲酸乙酯为底物,对从土壤样本中富集的产脂肪酶菌株及实验室保存的冻干菌粉进行筛选。筛选到一株对底物有较高立体选择水解活性的产酶菌株。通过菌落形态观察、革兰氏染色、16S rDNA比对和BIOLOG生理生化分析等方法进行菌种鉴定,确定该菌株为阿氏芽孢杆菌(Bacillus aryabhattai),并命名为Bacillus aryabhattai B8W22。保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏号:CCTCC NO:M 2017621。2.设计了单因素实验,优化了Bacillus aryabhattai B8W22的发酵产酶条件。实验结果表明葡萄糖为最佳碳源,酵母提取物为最佳氮源。优化以后的发酵培养基配方如下(g/L):葡萄糖15,酵母提取物20,MgSO4?7H2O 1.0,NaCl 0.5,pH7.2。在35℃,180 rpm条件下培养24小时后,Bacillus aryabhattai B8W22有最高的菌体量和酶活,菌体干重约为8 g/L,酶活为4.5 U/mL。3.以真空冷冻干燥法制备的Bacillus aryabhattai B8W22冻干菌粉为催化剂,研究不同催化条件下冻干菌粉对(R,S)-吲哚啉-2-甲酸乙酯的水解拆分效果。确定了较为合适的水解拆分条件:在1.5 mL的反应体系中,加入0.05 g Bacillus aryabhattai B8W22冻干菌粉、0.025 g吲哚啉-2-甲酸乙酯,助溶剂为正己烷,添加量为20%(V/V)。在pH为7.0,35℃条件下反应1.5小时,产物酸的e.e.为96%,此时的转化率达到33%。对水解反应后的产物进行了结构鉴定,核磁共振氢谱和质谱结果表明,水解产物符合(S)-吲哚啉-2-甲酸的结构特征。这说明利用生物法一步拆分外消旋吲哚啉-2-甲酸乙酯制备(S)-吲哚啉-2-甲酸的工艺路线切实可行。
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