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研究背景和目的：
肝癌是全球范围内常见的肿瘤性疾病，其发展迅速，缺乏很有效的治疗方式，预后不良，肝癌患者的总生存期也普遍较短，死亡率居高不下，急需研究更有效的治疗手段。雌激素受体的新亚型ERα36与常见的雌激素受体ERα66相比，具有变异的配体结合域，推测能够与更多的配体分子发生结合。目前的研究发现ERα36在多种肿瘤细胞中的异常表达与肿瘤的发生发展以及患者的不良预后相关。ERα36表达水平在正常肝脏组织中不表达或表达水平较低，而在病变的肝组织中升高，也说明ERα36可能在肝癌的发生与发展中发挥了一定的作用，可作为潜在的治疗靶点进行研究。EGCG作为自然界广泛存在的天然化合物，其抗肿瘤作用引起了越来越多研究人员的兴趣，但其发挥抗肿瘤作用的机制复杂且其直接作用靶点尚未完全明确。本课题组在前期的工作中，通过分子对接的方式发现EGCG可与ERα36结合发挥抑制作用，因此本课题即对EGCG是否可通过抑制肝癌细胞异常表达的ERα36发挥抗肝癌的作用展开研究，这可能会为肝癌的有效精准治疗带来新的思路。
第一部分：ERα36在肝癌细胞中的表达
我们首先检测了几种不同的雌激素受体在肝癌细胞内的表达，根据Westernblot结果筛选出高表达ERα36的肝癌细胞系，并检测EGCG在不同水平表达ERα36的肝癌细胞系中的IC50值，初步判断ERα36的表达与EGCG抑瘤作用的关系。
结果表明：在所有肝癌细胞中均未检测到ERα66的表达，hcc-lm3、Huh7、SMMC7721细胞中检测到了低水平的ERβ，在L-02、Hep3B、sk-hep1、hcc-lm3、Huh7细胞中检测到了ERα36的表达，且这5种细胞所对应的IC50值分别是73.761μg/ml、50.807μg/ml、65.295μg/ml、68.376μg/ml、83.818μg/ml。在ERα36(+)的肝癌细胞中，ERα36表达水平越高，对EGCG的抑制作用越敏感。
第二部分：EGCG对肝癌细胞的抑制作用
我们选用高表达ERα36的Hep3B人肝癌细胞系及人正常肝脏细胞系L-02作为实验对象，分别在体内与体外进行细胞的抑制实验，进一步明确EGCG对肝癌的抑制作用。在体外实验中，通过绘制不同浓度EGCG处理后细胞的生长曲线来观察EGCG对细胞增殖的影响；通过流式细胞仪检测对细胞凋亡的作用；在体内实验中，以瘤体大小为开始与终止治疗的标准，持续检测不同剂量EGCG作用下，肿瘤生长速度的变化，并通过HE染色观察瘤体内的坏死情况。
结果表明：在30μg/ml浓度下，EGCG能够显著抑制肝癌细胞Hep3B的增殖，同时诱导细胞凋亡的发生，但没有抑制L-02的生长，也未促进L-02凋亡的发生；在60μg/ml浓度下，EGCG更显著的抑制了Hep3B细胞的增殖及原有活细胞的活性，对L-02也表现出了轻微的抑制作用，但未诱导L-02细胞发生凋亡。在体内环境下，肿瘤的生长速度随着EGCG剂量的升高逐渐减慢，且瘤体内坏死程度也随EGCG剂量的增加而加剧。
第三部分：EGCG对ERα36(+)肝癌细胞抑制作用的机制探究
在证实了EGCG的抑癌作用后，我们通过细胞免疫荧光及westernblot等方法，检测在不同浓度EGCG、或EGCG处理的不同时间点，ERα36表达、定位的变化，以及相关受体、增殖相关信号分子、凋亡相关蛋白表达的变化，来尝试找出EGCG抑制Hep3B细胞的具体机制。并通过检测EGCG对雌激素介导的细胞生长作用的影响来明确ERα36在EGCG抑制肝癌细胞过程中所扮演的角色及行使的功能。
结果表明：ERα36主要分布在胞质中，且EGCG的作用不改变其亚细胞定位；同一细胞的ERα36表达水平在低浓度EGCG作用下升高，在高浓度EGCG作用下降低；ERα36可能影响EGFR、Her-2等受体的表达，ERα36表达的升高可能导致EGFR、Her-2等受体分子表达量升高，ERα36表达的降低也会导致EGFR、Her-2等受体分子表达量降低；高浓度EGCG抑制MAPK等增殖相关信号通路，同时显著诱导细胞凋亡；胞核内p-ERK表达的降低可能与细胞增殖的抑制相关，胞质内p-ERK的持续高表达可能与EGCG对细胞造成的氧化损伤、凋亡相关；雌激素能削弱EGCG对细胞的抑制作用，ERα36是EGCG的作用靶点之一。
通过上述三部分的研究，可得出下述创新性结论：
1.ERα36是肝癌细胞中主要表达的雌激素受体亚型；
2.EGCG的细胞抑制作用具有选择性：对高表达ERα36的肝癌细胞表现出明显的抑制作用，并同时诱导细胞凋亡的发生，且作用效果随着浓度的升高而增强，但低浓度的EGCG对L-02细胞没有明显的抑制效果，高浓度EGCG对L-02稍有抑制，但不引起细胞凋亡；
3.ERα36是EGCG发挥肝癌抑制作用的靶点之一；
4.p-ERK在细胞核内降低、在胞质中升高可能与EGCG的抑癌作用相关；
5.ERα36异常聚集状态的改变可能与EGCG发挥作用相关，值得进一步研究。
肝癌是全球范围内常见的肿瘤性疾病，其发展迅速，缺乏很有效的治疗方式，预后不良，肝癌患者的总生存期也普遍较短，死亡率居高不下，急需研究更有效的治疗手段。雌激素受体的新亚型ERα36与常见的雌激素受体ERα66相比，具有变异的配体结合域，推测能够与更多的配体分子发生结合。目前的研究发现ERα36在多种肿瘤细胞中的异常表达与肿瘤的发生发展以及患者的不良预后相关。ERα36表达水平在正常肝脏组织中不表达或表达水平较低，而在病变的肝组织中升高，也说明ERα36可能在肝癌的发生与发展中发挥了一定的作用，可作为潜在的治疗靶点进行研究。EGCG作为自然界广泛存在的天然化合物，其抗肿瘤作用引起了越来越多研究人员的兴趣，但其发挥抗肿瘤作用的机制复杂且其直接作用靶点尚未完全明确。本课题组在前期的工作中，通过分子对接的方式发现EGCG可与ERα36结合发挥抑制作用，因此本课题即对EGCG是否可通过抑制肝癌细胞异常表达的ERα36发挥抗肝癌的作用展开研究，这可能会为肝癌的有效精准治疗带来新的思路。
第一部分：ERα36在肝癌细胞中的表达
我们首先检测了几种不同的雌激素受体在肝癌细胞内的表达，根据Westernblot结果筛选出高表达ERα36的肝癌细胞系，并检测EGCG在不同水平表达ERα36的肝癌细胞系中的IC50值，初步判断ERα36的表达与EGCG抑瘤作用的关系。
结果表明：在所有肝癌细胞中均未检测到ERα66的表达，hcc-lm3、Huh7、SMMC7721细胞中检测到了低水平的ERβ，在L-02、Hep3B、sk-hep1、hcc-lm3、Huh7细胞中检测到了ERα36的表达，且这5种细胞所对应的IC50值分别是73.761μg/ml、50.807μg/ml、65.295μg/ml、68.376μg/ml、83.818μg/ml。在ERα36(+)的肝癌细胞中，ERα36表达水平越高，对EGCG的抑制作用越敏感。
第二部分：EGCG对肝癌细胞的抑制作用
我们选用高表达ERα36的Hep3B人肝癌细胞系及人正常肝脏细胞系L-02作为实验对象，分别在体内与体外进行细胞的抑制实验，进一步明确EGCG对肝癌的抑制作用。在体外实验中，通过绘制不同浓度EGCG处理后细胞的生长曲线来观察EGCG对细胞增殖的影响；通过流式细胞仪检测对细胞凋亡的作用；在体内实验中，以瘤体大小为开始与终止治疗的标准，持续检测不同剂量EGCG作用下，肿瘤生长速度的变化，并通过HE染色观察瘤体内的坏死情况。
结果表明：在30μg/ml浓度下，EGCG能够显著抑制肝癌细胞Hep3B的增殖，同时诱导细胞凋亡的发生，但没有抑制L-02的生长，也未促进L-02凋亡的发生；在60μg/ml浓度下，EGCG更显著的抑制了Hep3B细胞的增殖及原有活细胞的活性，对L-02也表现出了轻微的抑制作用，但未诱导L-02细胞发生凋亡。在体内环境下，肿瘤的生长速度随着EGCG剂量的升高逐渐减慢，且瘤体内坏死程度也随EGCG剂量的增加而加剧。
第三部分：EGCG对ERα36(+)肝癌细胞抑制作用的机制探究
在证实了EGCG的抑癌作用后，我们通过细胞免疫荧光及westernblot等方法，检测在不同浓度EGCG、或EGCG处理的不同时间点，ERα36表达、定位的变化，以及相关受体、增殖相关信号分子、凋亡相关蛋白表达的变化，来尝试找出EGCG抑制Hep3B细胞的具体机制。并通过检测EGCG对雌激素介导的细胞生长作用的影响来明确ERα36在EGCG抑制肝癌细胞过程中所扮演的角色及行使的功能。
结果表明：ERα36主要分布在胞质中，且EGCG的作用不改变其亚细胞定位；同一细胞的ERα36表达水平在低浓度EGCG作用下升高，在高浓度EGCG作用下降低；ERα36可能影响EGFR、Her-2等受体的表达，ERα36表达的升高可能导致EGFR、Her-2等受体分子表达量升高，ERα36表达的降低也会导致EGFR、Her-2等受体分子表达量降低；高浓度EGCG抑制MAPK等增殖相关信号通路，同时显著诱导细胞凋亡；胞核内p-ERK表达的降低可能与细胞增殖的抑制相关，胞质内p-ERK的持续高表达可能与EGCG对细胞造成的氧化损伤、凋亡相关；雌激素能削弱EGCG对细胞的抑制作用，ERα36是EGCG的作用靶点之一。
通过上述三部分的研究，可得出下述创新性结论：
1.ERα36是肝癌细胞中主要表达的雌激素受体亚型；
2.EGCG的细胞抑制作用具有选择性：对高表达ERα36的肝癌细胞表现出明显的抑制作用，并同时诱导细胞凋亡的发生，且作用效果随着浓度的升高而增强，但低浓度的EGCG对L-02细胞没有明显的抑制效果，高浓度EGCG对L-02稍有抑制，但不引起细胞凋亡；
3.ERα36是EGCG发挥肝癌抑制作用的靶点之一；
4.p-ERK在细胞核内降低、在胞质中升高可能与EGCG的抑癌作用相关；
5.ERα36异常聚集状态的改变可能与EGCG发挥作用相关，值得进一步研究。