肺纤维化(Pulmonary fibrosis，PF)是由于多种原因导致的肺脏损伤，是一种进行性、破坏性疾病。病因包括毒物、自身免疫、药物、感染以及创伤等。PF的病理特点表现为片状慢性间质性炎症、过多的细胞外基质沉积、成纤维细胞增殖以及肺泡结构改变，导致进行性纤维化及肺功能丧失[1-3]。迄今为止，尽管已有多方面的实验及临床研究，但PF的发病率和死亡率依然呈增长趋势，而且平均存活期从确诊至死亡不超过3年[4，5]。PF的传统的治疗策略包括糖皮质激素或联合免疫抑制剂，然而这些药物的疗效正受到质疑，而且长期应用糖皮质激素通常会产生一些副作用，如免疫妥协、胃溃疡、高血压、骨质疏松、内分泌和代谢异常[1，6]。因此，迫切需要开发有效的、可以信赖的药物治疗PF。　　 氧化苦参碱(Oxymatrine，OM)，是从传统中药苦参中分离出来的生物碱。苦参已经被中国食品药品监督管理局批准用于乙肝治疗[7，8]。累积证据表明，OM具有多种生物和药理学特性，例如抗炎[9-11]、抗肿瘤[12，13]、抗凋亡[14]、抗纤维化[15]、抗氧化[16]及抗心律失常作用[17]。陈等[18]研究证实OM能够减轻博来霉素(bleomycin，BLM)诱导的小鼠肺纤维化，这种作用与抑制BLM诱导的肺炎症、脂质过氧化、成纤维细胞增殖和胶原合成相关。然而，OM对PF的抗纤维化作用的确切机制仍未被完全阐明。　　 一氧化氮(Nitric oxide，NO)是一种内源性短时存在的自由基，在许多肺疾病中发挥重要作用，包括PF[19,20]。目前有三种一氧化氮合成酶(NO synthase，NOS)，即神经型(nNOS)、内皮型(eNOS)、诱导型(iNOS)[21]。以前的动物模型和人类的PF研究中证实存在iNOS诱导的NO产生增加[22-24]。在PF中，转化生长因子β1(Transforming growthfactor-β1，TGF-β1)是公认的关键性致纤维生成细胞因子，可以导致胶原在肺部的过度生成和沉积[25]。在PF患者和动物模型的肺组织中已经发现TGF-β1的过高表达[26]。　　 根据上述的研究基础，我们假想在BLM诱导PF中，OM可通过抑制iNOS表达和TGF-β/smad信号途径发挥抗纤维化作用。　　 本实验目的:通过建立博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型，观察OM对小鼠肺纤维化抑制作用，并且进一步探讨其抗纤维化作用潜在的机制。　　 材料与方法：　　 50只C57BL/6鼠被随机分为5组:(1)对照组:气管滴注生理盐水;(2)模型组:气管滴注博来霉素诱导肺纤维化组(3.0mg/kg);(3)-(5)氧化苦参碱低、中、高剂量组:在滴注博来霉素一天后每天分别通过腹腔注射10，20，40mg/kg的氧化苦参碱进行治疗，连续注射21天。在博来霉素滴注后的第15天和22天分别收集支气管肺泡灌洗液和肺组织。HE染色法观测肺组织形态学改变。利用试剂盒检测肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6和NO的水平，以及肺组织匀浆中MPO的活性和MDA含量。通过免疫组化、RT-PCR、westem blot检测肺组织中iNOS的表达。此外，通过western blot检测肺组织中TGF-β1，Smad3，p-Smad3，Smad2,p-Smad2表达水平。　　 结果：　　 一、在博来霉素诱导鼠肺纤维化模型中，氧化苦参碱可以减轻肺组织病理改变　　 经氧化苦参碱治疗21天之后通过HE染色来评价肺部组织病理学改变。在普通光学显微镜下，阴性对照组的肺组织形态学显示为正常的肺泡腔和正常肺泡间隔。仅用博来霉素处理的小鼠肺组织显示明显组织病理学异常，表现为肺泡结构混乱、广泛的间隔增厚以及伴随淋巴细胞、中性粒细胞、成纤维细胞的密集间质浸润。与之形成对照，低中高剂量氧化苦参碱组分别显示出炎症细胞浸润以及间质增厚有适度的改善。　　 二、在博来霉素诱导鼠肺纤维化模型中，氧化苦参碱可以降低肺组织中MPO活性　　 MPO活性是中性粒细胞流入组织的一个标志，利用试剂盒对之进行检测。与阴性对照组相比，BLM滴注导致了MPO活性的急剧升高，从2.81±0.24升到8.23±0.35 U/g蛋白(P＜0.01，n=5)。然而，OM(10，20，40 mg/kg)治疗后，显著减低了MPO活性，分别从8.23±0.35到6.37±0.55(P＜0.01，n=5)，从8.23±0.35到6.07±0.47(P＜0.01, n=5)，从8.23±0.35到4.49±0.42(P＜0.01, n=5)。OM呈剂量依赖性抑制MPO活性。　　 三、在博来霉素诱导鼠肺纤维化模型中，氧化苦参碱可以降低肺泡灌洗液中TNF-α和I L-6浓度　　 BALF中TNF-a和IL-6代表促炎症反应介质，它们被认为在PF发病机制中发挥重要作用。利用ELISA方法进行检测，我们发现TNF-α和IL-6在阴性组最低限度表达。在BLM滴注2周之后，在BALF中观察到TNF-α和IL-6水平明显增加。然而，这些水平在OM应用后呈剂量依赖性下降，(P＜0.01，n=5)。　　 四、在博来霉素诱导鼠肺纤维化模型中，氧化苦参碱可以抑制TGF-β/smad信号转导　　 为了研究在BLM诱导的PF中，OM是否通过抑制TGF-β/Smad信号通路发挥抗纤维化作用，我们首先应用westemblot检测了肺组织中TGF-β1的蛋白表达，BLM的滴注可以明显增加肺组织中TGF-β1的蛋白表达，经过OM治疗可以呈剂量依赖性下调TGF-β1的蛋白表达。通过TGF-β1受体Ⅰ活化引起Smad信号磷酸化是TGF-β信号转导的始发的关键步骤，我们应用westemblot检测了BLM处理鼠肺中p-Smad2、p-Smad3。BLM组与阴性对照比，Smad2、Smad3磷酸化增加，OM治疗以剂量依赖性方式抑制BLM活化的信号分子。　　 五、在博来霉素诱导鼠肺纤维化模型中，氧化苦参碱可以降低肺组织中MDA水平　　 MDA做为脂质过氧化一个指标，在BLM滴注的第22天，利用试剂盒进行检测。阴性组为2.66±0.35 nmol/mg蛋白，BLM组为19.2±1.39 nmol/mg蛋白，显著升高(P＜0.01，n=5)。在OM(10，20，40 mg/kg)处理后，BLM诱导的脂质过氧化作用明显下降，分别为12.78±0.79(P＜0.01，n=5)，9.06±0.79(P＜0.01，n=5)，4.71±0.45 nmol/mg蛋白(P＜0.01，n=5)，分别与BLM组比较有统计学差异。OM降低MDA水平呈剂量依赖性。　　 六、在博来霉素诱导鼠肺纤维化模型中，氧化苦参碱通过抑制iNOS表达减少NO合成发挥抗纤维化作用　　 （一）氧化苦参碱可以降低肺泡灌洗液中NO的浓度　　 来自于iNOS的NO是一种与组织损伤相关的毒性分子。我们检测了BLM处理鼠BALF中NO含量。与阴性对照相比，BLM诱导PF模型组NO水平增加。OM治疗显著抑制BLM诱导BALF中NO水平上升(P＜0.01，n=5)。这种抑制作用呈剂量依赖性。　　 （二）氧化苦参碱可以抑制肺组织中iNOS表达　　 首先应用免疫组化方法检测肺组织中iNOS表达。阴性组，在少量的肺泡巨噬细胞可以微弱的发现iNOS阳性信号。在BLM滴注22天后，在肺泡上皮细胞、肺泡巨噬细胞和微血管内皮细胞可明显地观察到iNOS阳性信号。而OM在20和40 mg/kg剂量显著减弱BLM诱导的肺组织中iNOS表达的上升，而在10 mg/kg剂量几乎没有看到iNOS表达下降。　　 为了进一步确定在BLM诱导鼠PF中iNOS表达，分别应用RT-PCR和westernblot分析检测iNOS mRNA和蛋白水平。与阴性对照比较，在BLM组，iNOS mRNA水平明显增加。OM应用呈剂量依赖性减弱BLM诱导PF中鼠肺组织的iNOSmRNA(P＜0.01，n=5)。与此同时，westemblot分析观察到的变化与RT-PCR相一致。　　 结论：　　 在BLM诱导小鼠肺纤维化模型中　　 一、氧化苦参碱可以减轻小鼠肺组织病理改变。　　 二、氧化苦参碱通过抑制肺组织MPO活性及肺泡灌洗液中TNF-α、 IL-6的释放发挥抗炎症作用。　　 三、氧化苦参碱通过抑制TGF-β/Smad信号通路发挥抗纤维化作用。　　 四、氧化苦参碱通过降低肺组织MDA水平发挥抗脂质过氧化作用。　　 五、氧化苦参碱通过抑制iNOS表达减少NO释放从而发挥抗纤维化作用。